原发性肝细胞癌组织VEGFC和CD44v6表达及意义

【摘要】  目的 探讨血管内皮细胞生长因子C（VEGFC） 和CD44v6在原发性肝细胞癌（简称肝癌）中的表达及其与肝癌部分生物学行为的关系。方法 采用常规SP免疫组织化学染色法检测33例原发性肝癌组织中VEGFC和CD44v6的表达，并以21例肝硬化组织、16例肝外伤或肝囊肿组织作为对照，分析其表达水平与肝癌部分生物学行为的关系。结果 VEGFC 定位于肝癌细胞的胞质，阳性表达率为78.8%，CD44v6主要定位于肝癌细胞的胞膜及胞质，阳性表达率为72.7%。二者在肝癌组织中的阳性表达率均明显高于癌旁组织（χ2=12.157、10.280，P<0.05）；在发生转移的肝癌组织中的阳性表达率明显高于无转移的肝癌组织（χ2=4.930、8.088，P<0.05）；在正常肝脏组织及肝硬化组织中几乎不表达。VEGFC 和CD44v6的表达与肝癌组织学分级、肿瘤大小、是否并发肝硬化、AFP表达、有无HBV感染无关。VEGFC 和CD44v6在肝癌组织中的阳性表达呈正相关（r=0.681，P<0.01）。结论 VEGFC和CD44v6的表达与肿瘤侵袭转移的发生有关，可作为估计预后的指标。

【关键词】  癌 肝细胞 血管内皮生长因子C 抗原 CD44 免疫组织化学

　　EXPRESSIONS AND SIGNIFICANCE OF VEGFC AND CD44v6 IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA

　　LIU SHENG, L HONG, CONG SHUYING

　　(Infectious Disease Hospital of Qingdao, Qingdao 266033, China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expressions of VEGFC and CD44v6 in hepatocellular carcinoma (HCC) and their association with biological behavior of  the disease.MethodsThe expressions of VEGFC and CD44v6 in liver tissue of 33 HCC patients were examined by immunohistochemical staining, and 21 patients with portal hypertension and 16 hepatictrauma patients served as controls. ResultsVEGFC was expressed in cytoplasma in cancer tissues. The positive expression rate of VEGF was 78.8%. The expression of CD44v6 was located in membranes as well as cytoplasma in HCC,  expression rate being 72.7%. The expression rates of both VEGF and CD44v6 in HCC were significantly higher than that of the adjacent tissues (χ2=12.157,10.280;P<0.05), VEGF and CD44v6 expressions in metastasis were significantly higher than that in the nonmetastasis (χ2=4.930,8.088;P<0.05). Hardly any expressions of VEGFC and CD44v6 were noted in normal liver or  cirrhotic tissue. The expressions of VEGFC and CD44v6 had nothing to do with tumor size and grade, AFP level, presence or absence of cirrhosis or HBV. There was a positive correlation between VEGFC and CD44v6 in HCC (r=0.681,P<0.01). ConclusionThe expressions of VEGFC and CD44v6 are correlated with tumor metastasis and invasion, which may be used as an index for estimating the prognosis of HCC.
    
　　［KEY WORDS］Carcinoma, hepatocellular; Vascular endothelial growth factor C; Antigens, CD44; Immunohistochemistry
     
　　据WHO统计，原发性肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，年发病率超过37/10万，为全球之首。一旦发生肝外转移，病人的中位生存期仅为2.7个月[1]。但其浸润和转移的机制不十分清楚，探索肝癌的生长和转移的机制，必将为其临床治疗和预后判断提供合理的依据。本实验以免疫组织化学法检测血管内皮细胞生长因子C（VEGFC） 和CD44v6 在肝细胞癌（简称肝癌）中的表达，研究其与肝癌病理特征的关系，进一步探讨肝癌浸润和转移的机制。

　　1   材料与方法

　　1.1   标本采集
    
　　选取1999～2006年间青岛市海慈医疗集团手术切除原发性肝癌标本33例，其中男20例，女13例，年龄38～85岁，平均（58.0±10.8）岁。均经手术后病理切片证实为肝细胞癌，其中高分化者5例，中分化者19例，低分化者9例。TNM 分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期12例，Ⅲ期16例，Ⅳ期2例。单结节者26例，多结节者7例。肿瘤直径≤5 cm者11例，＞5 cm者22例，平均直径（7.6±3.1） cm。伴有转移者（淋巴结转移、门静脉癌栓、侵犯邻近器官及远处转移）17例。7例并发肝硬化。术前检查甲胎蛋白（AFP）阳性者30例，HBsAg阳性者34例。另选取21例肝硬化、16例肝外伤及肝囊肿病例作为对照，其中男22例，女15例，平均年龄（50.0±16.0）岁。取上述病人手术切除存档的石蜡包埋的标本连续切片，免疫组化染色。

　　1.2   检测方法
    
　　VEGFC和CD44v6检测采用常规SP免疫组织化学染色法。兔抗人VEGFC多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，鼠抗人CD44v6单克隆抗体购于北京中山生物科技公司，过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组织化学染色试剂盒购自北京中山生物科技公司。用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，DAB显色，具体操作流程如下：石蜡切片，常规脱蜡至水；蒸馏水冲洗，PBS浸泡 5 min；体积分数0.03 H2O2孵育5～10 min；微波修复10 min，自然冷却至室温；加试剂A室温孵育10～15 min，倾去；加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜；PBS 冲洗3 min，共3次；加试剂B，室温孵育20 min；PBS冲洗3 min，共3次；加试剂C，室温孵育20 min；PBS 冲洗5 min，共3次；DAB显色；自来水充分冲洗；苏木精轻度复染，常规脱水，透明，树脂封片。

　　1.3   结果判定
    
　　VEGFC阳性颗粒定位于肿瘤细胞的细胞浆，以肿瘤细胞及血管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。CD44v6定位于细胞膜及细胞浆，以肿瘤细胞的胞膜及胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。用低倍镜和高倍镜观察切片，判断标准根据以下两个方面。①按切片中显色癌细胞数比例记分：无癌细胞显色为0分；显色癌细胞占癌细胞总数＜25%为1分；显色癌细胞超过切片中癌细胞总数的25%但小于50%为2分；显色癌细胞超过切片中癌细胞总数的50%为3分。②按切片中癌细胞显色强度计分：癌细胞无显色为0分；呈浅黄色（弱染色）为1分；呈棕黄色（中等染色）为2分；呈棕褐色（强染色）为3分。将两项相加＞3分记为阳性，≤3分记为阴性。

　　1.4   统计学处理
    
　　计数资料比较用χ2检验，用PPMS 1.5[2]统计软件处理。

　　2   结果

　　2.1   肝癌组织中VEGFC 和CD44v6表达
    
　　VEGFC阳性颗粒定位于肿瘤细胞的细胞浆，分布呈异质性，强阳性染色的肿瘤细胞多位于肿瘤浸润边缘及肿瘤包膜附近。肝癌组织VEGFC 阳性表达率为78.8%（26/33）。CD44v6阳性表达主要定位于肝癌细胞的胞膜，呈线性着色，同时伴有细胞质阳性，在肝癌组织和正常肝脏交界处以及肝内微血管部位密集处尤为明显。CD44v6 阳性表达率为72.7%（24/33）。两者在肝癌组织中的阳性表达呈正相关（r=0.681，P<0.01）。

　　2.2   癌旁组织、肝硬化组织及正常肝脏组织中VEGFC 和CD44v6的表达
    
　　VEGFC、CD44v6 在癌旁组织中的表达率分别为36.4%（12/33）、33.3%（11/33），与肝癌组织比较差异有显著性（χ2=12.157、10.280，P<0.05）。VEGFC在正常肝脏组织及肝硬化组织中几乎不表达；CD44v6在正常肝脏组织及肝硬化组织中几乎不表达或仅在少量淋巴细胞及间质细胞中呈弱阳性表达。癌旁组织中VEGFC 和CD44v6的表达率在肝癌转移组与无转移组分别为41.2% （7/17）、31.3%（5/16）和35.3%（6/17）、31.3%（5/16），差异无显著性（P>0.05）。

　　2.3   肝癌组织中VEGFC 和CD44v6表达与临床病理特征的关系
    
　　VEGFC 和CD44v6在有转移组的表达明显高于无转移组，差异有显著性（χ2=4.930、8.088，P<0.05）,而与肿瘤大小、有无肝硬化、AFP水平、有无HBV感染、肿瘤细胞的分化程度无关（P＞0.05）。见表1。

　　表1   CD44v6 和VEGFC表达与肝癌临床病理特征的关系（略）

　　与无转移组比较，*χ2=4.930、8.088，P<0.05

　　3   讨论
    
　　肝癌为常见消化系统肿瘤之一，易发生侵袭和转移，肝癌根治切除后的5年复发率高达61.5%。肝癌的复发转移目前已成为影响肝癌病人疗效和获得长期生存的关键之一。肝癌的早期诊断、有效控制术后复发和转移直接关系到病人的预后。探索一些有关的生长和转移的相关因子，并对其生长、转移和复发进行预示性判断，必将为临床治疗提供新的线索。
    
　　VEGFC是VEGF家族中一类特殊的成员，结构与VEGF具有同源性，主要通过与受体VEGFR2及VEGFR3结合发挥作用。大量的实验研究表明，VEGFC是重要的肿瘤淋巴管生成因子，而且还能促进实验性肿瘤的淋巴结转移[3]。许多临床研究也证明,在人类众多肿瘤中，VEGFC 可促进肿瘤淋巴管生成及增加淋巴管密度，VEGFC表达水平与区域淋巴结转移显著相关[3]。同时，部分研究显示,VEGFC还参与肿瘤的血管生成过程，也导致了癌组织向其他部位转移[4]。
    
　　CD44是黏附分子中重要的成员，是一种细胞表面跨膜蛋白分子，广泛分布在粒细胞、上皮细胞和内皮细胞上，主要参与淋巴细胞的激活及细胞细胞、细胞基质之间的特异性粘连过程。CD44的基因位于人类第11号染色体短臂上，至少由19～20种外显子组成，按其外显子的转录片段是否参与选择性拼接，可以分成CD44s和CD44v两大类。CD44v主要功能体现在机体的病理过程中，它改变了肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，使肿瘤侵袭能力上升，尤其是CD44v6在肿瘤的浸润、转移和预后中的作用越来越引起众多学者的重视[6]。
    
　　但是有关VEGFC 和CD44v6在肝癌组织及其癌周组织中的研究尚少见报道。本研究结果显示，VEGFC 和CD44v6在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常肝组织，在转移组中的表达明显高于未转移组，而与肿瘤大小、有无肝硬化、AFP水平、有无HBV感染、肿瘤细胞的分化程度均无相关性；同时二者在肝癌中的表达具有较高的相关性。从而证实VEGFC 和CD44v6在肝癌生长和转移复发中起着重要作用，并在肝癌的发生、细胞增殖、分化和转移的过程中可能具有协同作用。其机制可能为：CD44v6是一种细胞表面细胞外基质（ECM）分子受体，通过与胞外多种基质成分结合，一方面介导了肿瘤细胞与ECM的黏附，有利于肿瘤细胞在原发病灶部位定居；另一方面还可以激发活体细胞内某些信号的传导机制，使肿瘤细胞分泌蛋白水解酶，加速胞外基质的降解，为肿瘤血管生成提供有利条件，有利于肿瘤细胞的扩散[7]。VEGFC是淋巴管生成有力的诱导剂，可通过激活并结合VEGFR3而形成VEGFCVEGFR3信号通道，进而调节淋巴管的生长，而增生或扩张的淋巴管为肿瘤细胞淋巴转移提供途径。应用淋巴管内皮细胞特异标记物LYVE1进行免疫染色显示，VEGFC不仅可促进瘤周及瘤内形成新的淋巴管，而且可促进原有淋巴管增生，管径增加，并诱导淋巴管间及淋巴管与血管相互融合，从而促进淋巴及血性转移[8]。另外，VEGFC水解后的成熟形式与VEGFR2配体结合可激活血管内皮细胞基因，增强尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物，并减弱纤溶酶原激活物抑制物的表达，进而诱导蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的产生，促进血管的形成，改善细胞对营养和氧的需求，促进肝癌细胞的侵袭和转移。
    
　　我们认为，VEGFC 和CD44v6的表达水平可反映肝癌侵袭、转移能力，在肝癌的预后判断和临床治疗中有重要价值，从而为临床评价病情及制定治疗方案提供依据。可通过抑制VEGFC 和CD44v6的表达来抑制新生血管及淋巴管的形成，降低肝癌浸润转移能力，为防治肝癌的转移和复发提供新的思路。

【参考文献】
  　　[1]SUGIMOTO C, SAITO A, KIKUZATO M, et al. Angioechographic evaluation of tumor thrombi and the effect of transcatheter arterial embolization in patients with hepatocellular carcinoma [J]. J Gastroenterol, 2002,37(5):363368.

　　[2]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[3]JELTSCH M, KAIPAINEN A, JOUKOV V, et al. Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGFC transgenic mice[J]. Science, 1997,276(5317):14231425.

　　[4]董绍安,徐平,赵景岚. 非小细胞肺癌VEGFC和VEGFR3表达对淋巴管生成和淋巴转移的意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1):67.

　　[5]CAO Y, LINDEN P, FARNEBO J, et al. Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(24):1438914394.

　　[6]谷化平,尚培中. CD44v6和PTEN表达与结直肠癌浸润和转移关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1):35.

　　[7]TANABE K K, ELLIS L M, SAYA H. Expression of CD44R1 adhesion molecule in colon carcinomas and metastases[J]. Lancet, 1993,341(8847):725726.

　　[8]PADERA T P, KADAMBI A, DI TOMASO E, et al. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics[J]. Science, 2002,296(5574):18831886.

　　（本文编辑 马伟平）

作者单位：青岛市传染病医院4区，山东 青岛 266033； 青岛市海慈医疗集团病理科