IP6诱导HT29细胞凋亡中线粒体通路的实验研究

【摘要】  目的 探讨bcl2、细胞色素C（CytC）及Ca2+参与的线粒体通路在肌醇六磷酸（IP6）诱导人结肠癌HT29细胞凋亡过程中的作用。方法 以3.3 mmol/L的IP6作用3 d和6个月的HT29细胞为实验组，以未经IP6作用的HT29细胞作为对照。应用RTPCR法测定IP6 作用不同时间细胞内bcl2 mRNA表达的改变，免疫细胞化学法检测细胞内CytC水平的变化，Fura2法测定IP6对HT29细胞内Ca2+表达的影响。结果 与对照组相比，IP6作用组均有效抑制bcl2的表达，上调胞浆内CytC及Ca2+水平。结论 在IP6 诱导HT29细胞凋亡的过程中，bcl2、CytC、Ca2+ 等因素参与的线粒体凋亡通路可能起到了重要的作用。

【关键词】  植酸；结肠肿瘤；HT29细胞；基因,bcl2；细胞色素C；细胞凋亡

EXPERIMENTAL STUDY OF MITOCHONDRIAL PATHWAY IN IP6INDUCED HT29 CELL APOPTOSIS  ZHANG XIAONI, LENG CHUANLI, SONG YANG (Institute of Nutrition and Food Hygiene, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the role of mitochondrial pathway in which bcl2, Cytochromec (CytC) and Ca2+  participated in inositol hexaphosphate (IP6) induced apoptosis of HT29 human colon carcinoma cell line. Methods HT29 cells were exposed to the same concentrations of IP6 (3.3 mmol/L) for different time: three days or six months. RTPCR was used to detect the expression of bcl2, and immunocytochemical stain used to test the level of CytC, Fura2/AM to assay the concentration of intracellularfree calcium.  Results Compared with the control group, the differenttime IP6 effectively decreased expressions of bcl2,and increased the intracellular concentration of CytC and Ca2+. Conclusion In the process of apoptosis of HT29 cells induced by IP6, the bcl2, CytC, Ca2+ and other factors play an important role in mitochondrial apoptosis pathway.

    ［KEY WORDS］ Phytic acid; Colonic neoplasms; HT29 cell; Gene, bcl2; Cytochromes C; Apoptosis

    肌醇六磷酸（IP6）又名植酸，易溶于水，其水解产物是肌醇和无机磷酸。近年来一些研究表明，IP6可能通过调节信号转导，调控细胞周期控制基因、癌基因、抑癌基因而参与细胞增殖和凋亡等重要生命活动，从而发挥抗癌功能[1]，但目前有关IP6 的抗癌机制尚不清楚。本实验室以前实验结果证实，1.8、3.0、5.0、8.0及13.0 mmol/L的 IP6均能有效抑制HT29细胞增殖[2]，促进其凋亡。经IP6作用的HT29细胞出现明显的形态学改变，而且caspase3 mRNA表达发生改变[3]。本实验在以前的实验基础上选取作用较明显的浓度，即3.3 mmol/L IP6作用于HT29细胞，观察其长期作用对HT29细胞凋亡的影响，探讨Ca2+、bcl2及细胞色素C（CytC)等参与的线粒体凋亡通路在其中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料来源

    人结肠癌细胞系HT29细胞购自北京协和医科大学细胞库，呈单层贴壁生长。

    1.2  主要试剂

    IP6 为Sigma公司产品；DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、TRIzol试剂为GIBCO公司产品；反转录试剂盒为Promega公司产品。

    1.3  主要仪器及设备

    BNP310恒温CO2培养箱为日本TABAI ESOEC公司产品；PCR仪为Biometra公司产品；ViDAS21图像分析系统由德国欧波同公司生产；天能凝胶图像分析系统由上海天能科技公司生产。

    1.4  方法

    1.4.1  细胞的培养及处理  将HT29 细胞培养于含有体积分数0.10胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/Ham F12 培养基中，置37 ℃、体积分数0.05的 CO2培养箱中培养。实验组细胞为经3.3 mmol/L IP6作用3d、6个月的HT29细胞，以未经IP6作用的相同培养时间的HT29细胞作为对照。

    1.4.2  RTPCR检测细胞内bcl2 mRNA表达的变化  半定量RTPCR实验参照试剂盒说明操作，产物经琼脂糖凝胶电泳并采用图像分析软件BandScan 5.0 比较两条电泳条带的相对吸光度值,获得bcl2 mRNA 相对表达量。引物均由DNAstar软件设计，由上海生工生物技术服务有限公司合成。

    1.4.3  免疫组织化学法测定细胞内CytC的变化细胞常规消化离心， PBS溶液清洗并调整密度为108/L左右，滴片，冷丙酮固定后，按二步法进行免疫细胞化学染色，DAB显色剂显色，光化学显微镜下观察后封片，显微镜下观察分析。

    1.4.4  Fura2法测定IP6对HT29细胞内Ca2+ 表达的影响  收集细胞，37 ℃水浴10 min，加入Fura2，37 ℃温浴30 min。以含BSA的Dhank液洗涤，调整密度为3×109/L，37 ℃水浴2～3 min。以激发波波长分别为340 nm和380 nm，发射波长为500 nm，狭缝宽度为5 nm，激发时间为1 s，测定各管荧光强度，以未负载Fura2的细胞悬液调零。测定完毕每管中各加体积分数0.01的Triton r100裂解细胞膜，再次测定两个激发波波长的荧光强度。之后在每管细胞悬液中再各加入体积分数0.04的络合剂EGTA，混匀静置后，再次测定两个激发波波长的荧光强度。并计算Ca2+的浓度[4]。

    1.5  统计处理

    实验结果采用PPMS 1.5统计软件[5]进行处理，计量资料的比较采用t检验。

    2  结    果

    2.1  细胞内bcl2 mRNA表达的变化

    图1显示，PCR产物经凝胶电泳鉴定，扩增片段特异性强。6月时实验组bcl2表达均较对照组明显降低（t=4.743，P＜0.01），且两个实验组之间表现出明显的降低趋势（t=3.162，P＜0.01），对照组之间差异无显著性。见表1。

    2.2  细胞内CytC的变化

    实验组细胞内CytC表达与对照组相比差异具有显著性（t=3.834、4.026，P＜0.01），且3 d组与6月组相比差异也有显著性（t=2.369，P＜0.05）。见表1。

    2.3  IP6对HT29细胞内Ca2+ 浓度的影响

    实验组作用3 d、6月时Ca2+ 浓度与对照组相比均显著升高（t=2.622、4.317，P＜0.01），且6月组明显高于3 d组，差异有显著性（t=2.783，P＜0.05）。见表1。

    图1  RTPCR法测定 IP6对HT29细胞bcl2表达的影响

    ①为0 mmol/L作用3 d的bcl2 mRNA的表达;②为3.3 mmol/L作用3 d的bcl2 mRNA的表达;③为0 mmol/L作用 6月的bcl2 mRNA的表达;④为3.3 mmol/L作用6月的bcl2 mRNA的表达 表1  IP6作用不同时间对HT29细胞内bcl2、CytC表达及Ca2+ 浓度的影响

    3  讨    论

    细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序性的死亡过程，其发生受到机体的严密调控。不少疾病的发病与凋亡有关。许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路而达到抑制肿瘤生长的目的。研究调控肿瘤细胞凋亡的分子机制是目前肿瘤学的重要课题,以药物诱导肿瘤细胞凋亡也被用于新的抗肿瘤药物的筛选。

    细胞形态学上的变化是判断凋亡发生最可靠的标准。我们以往实验将IP6作用于HT29细胞，观察到了典型的凋亡的形态学改变，证实了IP6可以诱导细胞凋亡，且证实了caspase3在其中起到了很重要的作用[3]。本实验进一步从线粒体凋亡通路其他几个重要因素研究其促进凋亡的分子机制。

    大量的研究证据表明，线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一[6]。尽管凋亡信号多种多样，细胞类型也各不相同，但凋亡信号大多在线粒体水平整合和放大。线粒体经凋亡信号激活后，能够释放许多促凋亡因子至细胞浆中，如CytC等，激活下游凋亡信号。bcl2属于原癌基因，是一种重要的抗凋亡基因，能抑制多种因素引起的凋亡，对线粒体凋亡通路的影响是bcl2实现其凋亡调控的主要途径。bcl2在线粒体水平干扰凋亡信号整合的关键性步骤，其过表达可阻止线粒体将CytC 释放入胞质,即bcl2 在CytC上游发挥抗凋亡的作用,最终阻止CytC的释放。而CytC的释放促进凋亡体的形成，导致caspase家族的蛋白裂解活化，而引起细胞凋亡。细胞内Ca2+ 浓度升高是细胞凋亡的一个重要条件，钙泵特异性抑制剂Thapsigargen诱导的WEH17.2等细胞的凋亡可被bcl2所抑制，其原因是bcl2抑制了Ca2+的跨膜流动，提示bcl2可通过调节胞内Ca2+浓度来调节凋亡。本实验将IP6作用于HT29细胞不同时间，通过检测bcl2的表达及胞浆内Ca2+ 和CytC的水平，结果显示，经IP6处理的细胞在各个时间组均显示了bcl2 mRNA表达的下调及CytC和Ca2+上调，提示这些凋亡通路关键酶的激活可能是IP6能够诱导HT29细胞凋亡的重要原因，并进一步提示线粒体通路在IP6诱导HT29细胞凋亡的过程中可能起到了重要作用。

【参考文献】
  [1]SZWERGOLD B S. Graham RA and Brown TR: observation of inositol pentakisand hexakisphosphates in mammalian tissues by 31P NMR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1987,264: 874881.

[2]TIAN Y, SONG Y. Effects of inositol hexaphosphate on proliferation of HT29 human colon carcinoma cell line[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(26):41374142.

[3]宋莉,宋扬. IP6对人结肠癌细胞HT29凋亡caspase3基因作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(3):201204.

[4]张春光,郑海雷,马建华,等. 细胞内游离钙离子浓度的测定方法[J]. 生物学通报, 2002,37(10):1517.

[5]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1): 9193.

[6]詹启敏. 分子肿瘤学[M]. 北京：人民卫生出版社, 2005:38103.

作者单位：1 青岛大学医学院营养与食品卫生研究所，山东 青岛 266021; 2 青岛市海慈医院