硒对自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺细胞Caspase3、Bcl2和Bax蛋白表达影响

【摘要】  目的 探讨亚硒酸钠对实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）大鼠甲状腺组织Caspase3、Bcl2、Bax蛋白表达及分布的影响。方法 将Wistar大鼠分为正常对照组、EAT组和EAT加硒干预组。制备EAT大鼠模型，EAT加硒干预组给予亚硒酸钠灌胃进行干预。免疫组化SABC法检测大鼠甲状腺组织Caspase3、Bax、Bcl2蛋白的表达及分布，并应用美国Sample PCI图像分析系统进行平均吸光度测定，对免疫组化结果进行定量分析。结果与EAT组相比，EAT加硒干预组大鼠甲状腺组织滤泡破坏程度明显减轻，淋巴细胞浸润减少，Caspase3的阳性表达减少(F=45.01,q=7.32，P<0.05)，Bcl2/Bax有上升趋势。Bax阳性表达多位于浸润淋巴细胞附近的滤泡上皮，远离浸润淋巴细胞的滤泡上皮表达较少，而Bc12的阳性表达部位相反。EAT组大鼠甲状腺组织Caspase3的阳性表达与Bax的阳性表达呈正相关（r=0.89,P<0.01）,Caspase3的阳性表达与Bcl2的阳性表达呈负相关（r=-0.85,P<0.01）。结论 亚硒酸钠可能通过影响Bcl2/Bax比值，下调Caspase3的表达，抑制甲状腺细胞的凋亡来减轻或抑制自身免疫性甲状腺炎的免疫损伤。

【关键词】  甲状腺炎,自身免疫性；亚硒酸钠；基因,Bcl2；bcl2相关X蛋白质；Caspase3

 EFFECT OF SODIUM SELENITE ON EXPRESSIONS OF Caspase3, Bcl2, AND Bax OF EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE THYROIDITIS WANG TINGTING, YAN SHENGLI (Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ; ［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of sodium selenite on the expressions of Caspase3, Bcl2 and Bax in rats with experimental autoimmune thyroiditis (EAT). Methods Wistar rats were divided into normal control, EAT and EAT plus seleniuminterference (EATPSI) groups. A EAT model was established. Rats in EATPSI group were given sodium selenite(0.2 mg/kg) by intragastric administration. The expressions of Caspase3, Bcl2 and Bax were detected using immunohistochemical method and analyzed by Sample PCI pathological image system.  Results Compared with EAT group, the lymphocytes and positive Caspase3 staining in thyroid were fewer in EATPSI group (F=45.01,q=7.32,P<0.05). There was a tendency of rising of Bcl2/Bax. The positive Bax mostly located in the vicinity of the infiltration site, less were seen away from that part; the opposite part was manifested for positive Bcl2. The expression between Caspase3 and Bax showed  a positive correlation (r=0.89,P<0.01), and the positive expression of Caspase3 showed negative correlation with Bcl2 (r=-0.85,P<0.01). ConclusionSodium selenite can relieve or inhibit the immune damage of autoimmune thyroiditis probably by effecting the ratio of Bcl2/Bax,  down regulating the expression of Caspase3 and suppressing the apoptosis of thyroid cells.

    ［KEY WORDS］ Thyroiditis, autoimmune; Sodium selenite; Gene, bcl2; bcl2associated X protein; Caspase3

    自身免疫性甲状腺疾病(AITD)是一种临床常见的器官特异性自身免疫性疾病，由多种因素共同作用引起。目前研究结果显示，细胞的异常凋亡在AITD发生发展中有重要作用。硒是人体维持正常功能必需的微量元素之一，已经发现其与多种疾病的发生相关。甲状腺组织中含硒量较高，硒对于维持甲状腺正常的生物学功能有重要作用。有研究显示，一定浓度的硒可有效抑制H2O2诱发的脂质过氧化反应，拮抗自由基水平增高造成的人甲状腺细胞凋亡[1，2]。本文通过建立自身免疫性甲状腺炎（EAT）大鼠模型，然后用亚硒酸钠干预，探讨亚硒酸钠对EAT大鼠甲状腺组织Caspase3、Bcl2、Bax蛋白表达及分布的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  雌性Wistar大鼠36只，体质量为110～130 g，购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，许可证编号SCXK（鲁）20050017。所有动物购回后适应性饲养1周，称体质量后随机分为3组：正常对照组（A组）、EAT组（B组）和EAT加硒干预组（C组），每组12只。

    1.1.2  试剂与药品  兔抗大鼠Caspase3、Bax、Bcl2单克隆抗体，SABC免疫组化试剂盒，DAB显色剂均购于武汉博士德公司。猪甲状腺球蛋白、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂均购于Sigma 公司。碘化钠（分析纯）购于天津市巴斯夫化工有限公司。亚硒酸钠购于上海化学试剂采购供应站。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型制备  A组大鼠饮用过滤后的自来水，B、C组大鼠饮用含0.5 g/L碘化钠的水。各组大鼠喂以标准混合饲料。C组大鼠从实验第2周开始灌胃给予亚硒酸钠，剂量为0.2 mg/kg（浓度40 mg/L），每周称量体质量一次，及时调整灌胃液剂量。实验第15天，将猪甲状腺球蛋白100 mg 溶解于灭菌双蒸水50 mL中, 取10 mL与等体积完全弗氏佐剂充分混合成油包水状, 皮肤消毒后, 取 0.5 mL （100 μg）给B、C组大鼠右后足垫部进行皮下注射作为初次免疫。 实验第5周，取200 mg/L猪甲状腺球蛋白10 mL与不完全弗氏佐剂10 mL 充分混合成油包水状后，取0.5 mL（100 μg） 给B、C组大鼠背部多点皮下注射进行加强免疫, 以后每周加强免疫1次，至第10周末实验结束。

    1.2.2  标本的制备  实验结束时，大鼠称体质量后，以100 g/L水合氯醛(0.4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。在无菌条件下，迅速摘取甲状腺，40 g/L中性甲醛固定，然后依次进行脱水、透明、浸蜡，制备石蜡切片，4 ℃保存待用。

    1.2.3  检测指标  免疫组织化学染色观察甲状腺组织Caspase3、Bcl2、Bax 蛋白表达，按SABC法免疫组化试剂盒染色步骤进行，用PBS代替一抗作为阴性对照。Caspase3、 Bcl2、Bax阳性表达均为细胞浆呈棕黄（褐）色。所有标本均用美国Sample PCI图像分析系统进行吸光度值（A值）测定，每张切片随机测定5个视野取均值，以其作为切片的测定值。切片阳性表达的强弱与A值呈正相关，A值大则阳性表达强，反之亦然。

    1.2.4  统计学处理  应用SPSS 11.5统计软件进行处理。数据均以±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。变量之间相关关系采用Spearman相关分析。

    2  结    果

    2.1  各组大鼠甲状腺组织Caspase3阳性表达的比较

    A组大鼠甲状腺组织Caspase3阳性表达水平低，甲状腺滤泡呈中度大小，滤泡上皮细胞多呈立方形，滤泡腔内含有丰富胶质；B组大鼠甲状腺组织Caspase3阳性表达多见,强阳性细胞主要分布在淋巴细胞浸润附近的甲状腺滤泡上皮细胞,部分甲状腺滤泡萎缩、破坏, 滤泡结构消失；C组大鼠甲状腺组织Caspase3阳性表达较B组减少，滤泡破坏程度减轻。见表1。

    2.2  各组大鼠甲状腺组织Bcl2和Bax阳性表达的比较

    A组大鼠甲状腺组织Bc12、Bax阳性表达均较少；B组大鼠甲状腺组织淋巴细胞浸润处附近的甲状腺滤泡上皮细胞Bc12阳性表达亦较低, 而Bax阳性表达及着色程度均高于Bc12，远离淋巴细胞浸润处附近的滤泡上皮细胞Bc12、Bax阳性表达及着色程度均明显增多；C组大鼠甲状腺组织滤泡破坏程度减轻，淋巴细胞浸润减少,Bc12多位于滤泡结构较完整的区域,Bax多位于滤泡结构破坏明显的区域,弥漫分布。见表1。 表1  各组大鼠甲状腺组织Caspase3、Bax、Bcl2表达比较

    2.3  各指标之间的相关性

    B组大鼠甲状腺组织Caspase3的阳性表达与Bax的阳性表达呈正相关（r=0.89,P<0.01）, Caspase3的阳性表达与Bcl2的阳性表达呈负相关（r=-0.85,P<0.01）。

    3  讨    论

    细胞凋亡是由基因控制的细胞主动性死亡过程，对维持机体正常的生长发育、正常的代谢、免疫调节、自身耐受、内环境稳态等方面均有重要作用，细胞的异常凋亡可导致自身免疫性疾病、肿瘤、退行性疾病、神经变性疾病等多种疾病。近年来研究认为，甲状腺细胞异常凋亡状态与AITD的发生发展有密切关系[3]。正常甲状腺组织需要一个相对稳定的基础凋亡率来维持其内环境的稳定及甲状腺正常的生物功能。多种基因可影响细胞的凋亡。当细胞受到凋亡诱导因素作用后，经有关的信号转导系统的传递而激活凋亡基因，从而使细胞发生凋亡；细胞中同样也存在抑制凋亡的基因，对促进凋亡的基因起对抗作用。正常情况下，这两类基因处于平衡状态，以维持细胞正常的凋亡。其中，bcl2基因家族是与细胞凋亡关系非常密切的基因家族，通过自身编码的蛋白发挥诱导或抑制凋亡的作用。bcl2和bax是一对正负调节凋亡的基因，bax基因具有促进细胞凋亡的作用，bcl2基因则能阻遏损伤或刺激引起的细胞凋亡[4]。

　　蛋白和Bax蛋白通常形成异源二聚体，导致Bcl2蛋白失活，降低Bcl2蛋白对凋亡的抑制作用，从而促进凋亡的发生；Bax蛋白本身也可以形成同源二聚体直接抑制Bcl2蛋白的抗凋亡作用。因此，Bcl2和Bax二者表达的相对水平（Bax/Bcl2）是影响细胞凋亡的重要因素，Bax/Bcl2的比值越高，细胞凋亡越易发生，否则反之[5]。Caspase家族是细胞凋亡的主要执行者, 可灭活细胞凋亡的抑制物（Bcl2），水解细胞的蛋白质结构，导致细胞成分降解，并形成凋亡小体。在此过程中，Caspase3是细胞凋亡重要的效应分子,其可活化DNA酶,降解染色体,最终引起细胞凋亡[6]。因而在理论上，Caspase3蛋白的表达与细胞凋亡之间存在一定的相关性。

    硒是人体必需的微量元素之一，在体内参与多种酶的催化反应，具有明确的抗氧化、延缓衰老、增强机体免疫力等功能。低硒状态可能诱发或加重AITD细胞凋亡的异常状态[7]。有研究显示，适量补充硒可以减轻大鼠EAT的炎症反应，降低甲状腺自身抗体的水平[8]，表明适量补硒可减轻或抑制EAT的免疫损伤。本研究参照文献[8]，建立EAT动物模型，然后加亚硒酸钠进行干预，通过观察各组大鼠甲状腺组织Caspase3、Bcl2、Bax蛋白的表达及分布，探讨硒制剂减轻或抑制自身免疫性甲状腺炎免疫损伤的作用途径。本文结果显示，EAT组大鼠甲状腺组织淋巴细胞浸润处附近的滤泡上皮细胞Bc12阳性表达较少, Bax阳性表达及着色程度均高于Bc12，远离淋巴细胞浸润处附近的滤泡上皮细胞Bc12、Bax阳性表达及着色程度均明显增多，Caspase3阳性表达多见,强阳性细胞主要分布在淋巴细胞浸润处附近的滤泡上皮细胞,部分甲状腺滤泡萎缩、破坏, 滤泡结构消失。提示甲状腺细胞的异常凋亡与自身免疫性甲状腺炎的发病密切相关,淋巴细胞的浸润可能参与了细胞凋亡的发生和发展。本文结果还显示，EAT加硒干预组大鼠甲状腺组织滤泡破坏程度减轻，淋巴细胞浸润减少，Bax阳性表达多位于浸润淋巴细胞附近的滤泡上皮，远离浸润淋巴细胞的滤泡上皮表达较少，而Bc12的阳性表达部位则与之相反。EAT组大鼠甲状腺组织Caspase3的阳性表达与Bax的阳性表达之间呈正相关,而与Bcl2的阳性表达之间呈负相关。提示EAT大鼠甲状腺细胞凋亡增加，可能与促凋亡Bax蛋白的表达上调，抑制凋亡Bcl2蛋白的表达下调有关，从而使得Bcl2/Bax比值失衡，凋亡效应分子Caspase3的表达增多，诱导甲状腺细胞凋亡，破坏甲状腺滤泡结构。亚硒酸钠可能通过影响Bcl2蛋白和Bax蛋白的表达平衡，使得Bcl2/Bax比值上调，从Bc12阳性表达细胞多分布于甲状腺滤泡结构较完整的区域可见，Bcl2作为保护因子阻断细胞的凋亡。本文采用Caspase3免疫组化试剂盒，检测的是活化的Caspase3，因而理论上，Caspase3蛋白的表达可以用来推测其组织中细胞凋亡的发生情况。但Caspase3的阳性表达与细胞的凋亡情况是否有良好的相关性，仍需进一步研究。

【参考文献】
  [1]张方华,阎胜利,余霄龙,等. 硒对H2O2引起的人甲状腺细胞凋亡的影响[J]. 中国药物与临床, 2008,8(3):209211.

[2]张方华,阎胜利,余宵龙,等. 亚硒酸钠对体外培养人甲状腺细胞氧化损伤的影响[J]. 免疫学杂志, 2008,24(3):139141.

[3]田英娟. 细胞凋亡与自身免疫性甲状腺疾病[J]. 齐鲁医学杂志, 2005,20(6):557558.

[4]STELLER H. Mechanisms and genes of cellular suicide[J]. Science, 1995,267(10):14451449.

[5]林来祥,叶振坤. 碘对大鼠甲状腺细胞凋亡及Bax、Bcl2基因mRNA表达的影响[J]. 中国地方病学杂志, 2005,24(3):245247.

[6]SRINIVASULA S M, SALEH A, AHMAD M, et al. Isolation and assay of caspases[J]. Methods Cell Biol, 2001,66:127.

[7]TANG R, LIU H, WANG T, et al. Mechanisms of selenium inhibition of cell apoptosis induced by oxysterols in ratvascular smoothmuscle cells[J]. Arch Biochem Biophys, 2005,441(1): 1624.

[8]阎胜利,迟海燕,余霄龙,等. 硒对自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺超微结构的影响[J]. 免疫学杂志, 2007,23(5): 545548.

作者单位：青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003