姜黄素对人口腔鳞癌细胞增殖及凋亡的影响

【摘要】  　　目的 探讨姜黄素对人口腔鳞癌细胞Tca8113及Tb增殖的抑制及诱导凋亡作用。方法 分别应用6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的姜黄素作用Tca8113及Tb细胞24 h，采用MTT法检测姜黄素对口腔鳞癌细胞Tca8113及Tb增殖的抑制作用，形态学观察及流式细胞仪测定细胞凋亡。结果 6.25～50.00 μmol/L姜黄素能显著抑制口腔鳞癌细胞Tca8113和Tb细胞的增殖（F=793.94、391.08,q=6.00～62.68，P<0.05)。流式细胞仪检测显示口腔鳞癌细胞凋亡率随姜黄素浓度升高而增加。倒置显微镜下可观察到部分凋亡细胞出现染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变。结论 姜黄素对人口腔鳞癌细胞Tca8113及Tb的增殖具有显著的抑制作用，并可诱导细胞凋亡。

【关键词】  姜黄素　肿瘤，鳞状细胞　细胞凋亡

　　EFFECTS OF CURCUMIN ON PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF HUMAN ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA

　　PANG BAOXING, JIN XIAOMING, ZHANG XIAOYAN

　　(Department of Stomatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the inhibition and apoptosisinducing effects of curcumin on Tca8113 and Tb cells of human oral squamous cell carcinoma.  Methods Tca8113 and Tb cells were treated with different concentrations of curcumin(6.25, 12.50, 25.00, and 50.00 μmol/L), respectively, for 24 hours. MTT was used to determine the inhibition of curcumin. Morphological assay and flow cytometry were employed to detect the apoptosis.  Results The proliferation of Tca8113 and Tb cells were significantly inhibited by curcumin at all concentations applied (F=793.94,391.08;q=6.00-62.68;P<0.05). The results of flow cytometry demonstrated the apoptosis rate increased gradually along with the increase of concentrations of curcumin. Morphological changes including chromatic agglutination, karyopyknosis, and nuclear fragmentation could be observed in some of the cells under inverted microscope.  Conclusion Curcumin can notably inhibit proliferation and induce apoptosis of Tca8113 and Tb cells of human oral squamous cell carcinoma.
   
　　［KEY WORDS］ curcumin; neoplasms, squamous cell; apoptosis
   
　姜黄素是从中药姜黄中提取的一种酚类物质，它具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用，特别是其抗肿瘤的作用日益为人们所关注。国内外众多学者对姜黄素的抗肿瘤作用做了大量的研究，结果证实姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用[1]。本实验通过研究姜黄素对人口腔鳞癌细胞Tca8113及Tb增殖的抑制及诱导凋亡作用，为口腔鳞癌的治疗提供理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料
   
　　人舌鳞癌细胞系Tca8113及其脑转移亚系Tb由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室提供。姜黄素(Sigma公司) 以DMSO配成50 mmol/L储备液，置于-20 ℃冰箱保存，实验时以培养液稀释成实验浓度。RPMI 1640培养液(Gibco公司), 胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司），酶标仪（奥地利Tecan公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养 

　　Tca8113及Tb细胞生长于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度的CO2细胞培养箱内，倒置显微镜下观察细胞生长状态。

　　1.2.2  姜黄素对Tca8113及Tb细胞增殖的影响将细胞以5×107/L接种到96孔培养板内, 待细胞贴壁后分别加入终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的姜黄素，对照组仅加入RPMI 1640培养液，每种浓度均设5个复孔，分别孵育24 h。每组在实验终止前4 h加入10 μL MTT, 弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪测定570 nm波长处吸光度（A）值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组A值均数／对照组A值均数)×100%。

　　1.2.3  FCM检测细胞凋亡 

　　将细胞以1×108/L接种到6孔培养板内，待细胞贴壁后分别加入终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的姜黄素, 孵育24 h,收集各组细胞, PBS清洗离心，体积分数0.70冷乙醇固定细胞，上机前加含RNA酶的PI染液，4 ℃避光30 min后上机检测。

　　1.3  统计学处理
   
　　应用SPSS 11.5及PPMS 1.5[2]统计软件进行数据处理，各指标比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验。

　　2  结果

　　2.1  Tca8113及Tb细胞形态学变化
   
　　倒置显微镜下，对照组细胞贴壁生长，细胞呈梭形或多角形，胞浆丰富，生长旺盛，相邻细胞生长融合成片。加入不同浓度的姜黄素后，随着浓度的增加和作用时间的延长，Tca8113及Tb细胞开始变小、变圆，折光性增强，细胞贴壁性降低，呈现典型的凋亡形态，镜下可见染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变（图1、2）。

　　2.2  姜黄素对Tca8113及Tb细胞增殖的影响
   
　　对照组Tca8113及Tb细胞体外生长活跃，经6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的姜黄素处理24 h后，两种细胞的生长均呈现不同程度的抑制，并且呈剂量依赖性。不同浓度姜黄素处理Tca8113细胞及Tb细胞，其增殖抑制率的差异均有显著意义(F=793.94、391.08,q=6.00～62.68，P<0.05)。见表1。表1  不同浓度姜黄素对Tca8113及Tb细胞增殖抑制率的影响（略）

　　2.3  姜黄素作用后Tca8113及Tb细胞凋亡情况
   
　　6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的姜黄素分别作用于Tca8113及Tb细胞24 h后，其亚二倍体凋亡峰随药物浓度增加而逐渐增高，凋亡率呈现明显的上升趋势，表明姜黄素可以诱导Tca8113及Tb细胞的凋亡（图3）。

　　3  讨    论
   
　　口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，近年来发病率有增高趋势，预后较差[3]。目前使用的传统化疗药物多为细胞毒性药物,副作用较大,并且许多病人对其不敏感,严重影响了口腔鳞状细胞癌的治疗效果。因此，研究和开发新的抗肿瘤药物有着极其重要的意义。
   
　　从天然药物中提取有效成分用于治疗恶性肿瘤已经获得了广泛的应用，并成为国内外医药工作者关注的一个热点。姜黄素是中药姜黄的一种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用，尤其姜黄素的抗肿瘤作用日益引起人们重视[4]。国内外众多学者对姜黄素的抗肿瘤作用及其机制做了大量研究，证实姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的确切作用，然而有关其抗口腔鳞状细胞癌的研究却少见报道。
   
　　本研究采用人舌鳞癌细胞系Tca8113及其脑转移亚系Tb作为研究对象，舌癌脑转移细胞系Tb是吴军正等[5]在裸鼠体内实验中获得的人舌癌细胞系脑转移特例，并运用细胞培养技术建株，不仅具有舌癌细胞Tca8113所具有的特性，而且更易增殖、复发及转移。本文结果显示，姜黄素对Tca8113及Tb细胞的增殖抑制作用显著。此外，细胞形态学观察和流式细胞术检测表明，姜黄素以剂量依赖性方式增加亚二倍体凋亡峰，发挥诱导细胞凋亡作用。这些结果与AGGARWAL等[6]对包括MDA1986在内的多种头颈鳞癌细胞研究结果相一致。同时本文结果还显示，姜黄素对舌癌脑转移细胞系Tb的增殖抑制作用优于Tca8113，我们推测，姜黄素对口腔鳞癌高转移细胞系相关信号转导通路调控幅度较大是其可能的原因之一。
   
　　近年来，姜黄素作为一种植物来源的、低副作用的药物在肿瘤治疗方面研究极受重视，细胞实验和动物实验均证明姜黄素具有确切的抗肿瘤作用，如能对其作用机制和构效关系进行深入研究，将有望应用于口腔鳞状细胞癌的治疗和化学预防。

【参考文献】
  　　[1]KUNNUMAKKARA A B, ANAND P, AGGARWAL B B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins[J]. Cancer Lett, 2008,269(2):199225.

　　[2]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报， 2009,45(1):92.

　　[3]RAYBAUDDIOGèNE H, TéTU B, MORENCY R, et al. p53 overexpression in head and neck squamous cell carcinoma: review of the literature[J]. Eur J Cancer B Oral Oncol, 1996,32B(3):143149.

　　[4]ANAND P, SUNDARAM C, JHURANI S, et al. Curcumin and cancer: an “oldage” disease with an “ageold” solution[J]. Cancer Lett, 2008,267(1):133164.
　
　　[5]吴军正,陈建元,李峰,等. 舌癌脑转移细胞系Tb的建立及形态和生长特性[J]. 实用口腔医学杂志, 1999,15(6):452453.

　　[6]AGGARWAL S, TAKADA Y, SINGH S, et al. Inhibition of growth and survival of human head and neck squamous cell carcinoma cells by curcumin via modulation of nuclear factorkappaB signaling[J]. Int J Cancer, 2004,111(5): 679692.