甲状腺滤泡癌组织PAkt与PTEN表达及其与血管生成关系

【摘要】  　　目的 探讨磷酸化蛋白激酶B（PAkt）、磷酸酯酶基因（PTEN）异常表达与甲状腺滤泡癌血管生成之间的关系。方法 采用免疫组织化学PV6000两步法检测甲状腺滤泡癌、甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿标本中PAkt、PTEN、血管内皮生长因子（VEGF）及微血管密度（MVD）的表达。结果 PAkt在甲状腺滤泡癌组织中的表达较非甲状腺滤泡癌组织显著增高（χ2=43.45，P<0.001）。PTEN 蛋白在甲状腺滤泡癌组织中的表达显著降低。甲状腺滤泡癌组织中VEGF表达与非甲状腺滤泡癌组织比较差异有显著性（χ2=20.00，P<0.01）。甲状腺滤泡癌组织中 PAkt 表达与VEGF表达具有相关性(P=0.04)。结论 PAkt高表达在甲状腺滤泡癌发生发展及继发转移过程中可能发挥重要作用。甲状腺滤泡癌组织中PTEN的失表达可能通过调控PAkt促进肿瘤的侵袭与转移。VEGF在甲状腺滤泡癌的生长和转移中占重要地位，甲状腺滤泡癌中可能存在Akt/VEGF通路，Akt可能是调控VEGF表达通路中的关键因子。

【关键词】  甲状腺肿瘤　eIF2激酶　蛋白质PTEN　血管内皮生长因子类　免疫组织化学

　　RELATIONSHIP AMONG THE EXPRESSIONS OF PAkt, PTEN, AND  ANGIOGENESIS IN FOLLICULAR THYROID CARCINOMA 

　　JI FANGFANG, ZHAO PENG, WANG YANGANG

　　 (Qingdao Sanatorium of Shandong Province, Qingdao 266071, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the relationship among the abnormal expressions of PAkt, PTEN, and angiogenesis in human follicular thyroid carcinoma (FTC).  Methods Using immunohistochemical PV6000 method, the abnormal expressions of PAkt, PTEN, vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvessel density (MVD) in specimens of FTC and goiter were detected.The association of abnormal expressions of PAkt and PTEN  in FTC were detected.  Results The expression of PAkt in FTC was significantly higher than that in nonFTC tissue (χ2=43.45,P<0.01).  The expression of  PTEN in FTC was obviously decreased. The difference in VEGF expression between FTC and nonFTC tissues was significant (χ2=20.00,P<0.01). The correlation between the expressions of PAkt and VEGF in FTC was statistically significant (P=0.04).  ConclusionThe overexpression of PAkt might play an important role in the genesis and metastasis of FTC. The loss of PTEN expression might promote the invasion and metastasis of FTC through regulating the expression of PAkt. VEGF is also an important factor in the genesis and metastasis of FTC. There might be an Akt/VEGF pathway in FTC, in which Akt regulates the expression of VEGF.
   
　　［KEY WORDS］ thyroid neoplasm; eIF2 kinase; protein PTEN; vascular endothelial growth factor; immunochemistry
   
　　目前， 随着在分子和蛋白水平上对肿瘤研究的进展,现已发现不少癌基因和肿瘤标志物与甲状腺肿瘤的发生、发展、转归有关。甲状腺癌是常见的一类发生在内分泌腺的恶性肿瘤, 是多因素起源的癌基因和抑癌基因相互失衡导致的疾病，其常见类型为甲状腺乳头状癌与甲状腺滤泡癌。多年来研究表明,甲状腺滤泡癌与乳头状癌在病因、形成机制、生物学行为及预后上都有很大差别。本文通过检测甲状腺滤泡癌及甲状腺滤泡腺瘤组织Akt的活化形式磷酸化蛋白激酶B(PAkt)表达情况, 分析研究Akt基因在甲状腺滤泡癌演进过程中的变化规律及其意义，同时检测磷酸酯酶基因（PTEN）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和微血管密度(MVD) 的表达,探讨磷脂酰肌3激酶（PI3K)/Akt信号转导途径与甲状腺滤泡癌血管生成之间的关系。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料
   
　　收集我院病理科1996年1月—2006年9月间，存档的40例不同分化的甲状腺滤泡癌标本组织蜡块，其中男10例，女30例；年龄16～70岁，平均42岁。高分化6例，其中1例伴有局部淋巴结转移；中分化16例，其中2例伴局部淋巴结转移；低分化18例，其中5例伴局部淋巴结转移，7例伴全身转移。所有标本的切片均经过两位高年资病理医师的组织学回顾性分析。同时，选取10例甲状腺腺瘤及10例结节性甲状腺肿病人的标本作为对照。

　　1.2  方法
   
　　所有组织标本均经40 g/L的中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片5张；常规苏木精伊红染色1张；PAkt、PTEN、VEGF及CD34免疫组织化学染色4张。采用免疫组织化学PV6000两步法检测甲状腺滤泡癌、甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿标本组织中PAkt、PTEN、VEGF及CD34的表达，并计算微血管密度（MVD），操作按照试剂盒说明书进行。小鼠抗人PAkt单克隆抗体购自美国Cell Signling公司；小鼠抗人PTEN单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；小鼠抗人VEGF单克隆抗体、小鼠抗人CD34单克隆抗体及PV6000免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。用PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

　　1.3  结果判定标准
   
　　PAkt以细胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色; PTEN蛋白以细胞核上出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。记分参照IRS法[1]。每张切片随机选取10个高倍镜视野计数阳性细胞数并判断阳性细胞的着色强度。阳性细胞数计数：阳性细胞数<5％为0分；阳性细胞数5%～30％为1分；阳性细胞数31～60%为2分；阳性细胞数>60％为3分。阳性细胞的着色强度：淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两积分相乘，0分为阴性（－），1分为弱阳性（＋），2～4分为阳性（），>4分为强阳性（）。VEGF以着色细胞占视野细胞总数的多少分为4级:0级,0;1级<25%;2级,26%～50%;3级,>50%。0级为阴性,≥1级以上为阳性。MVD按WEIDNER[2]的判断标准判定。

　　1.4  统计学分析
   
　　采用SPSS 11.5及PPMS 1.5[3]统计学软件进行数据处理。

　　2  结果

　　2.1  PAkt、PTEN蛋白和VEGF在甲状腺滤泡癌中的表达
   
　　本文40例甲状腺滤泡癌组织中，PAkt的阳性着色主要位于癌细胞的胞浆。其中38例PAkt呈阳性表达，2例呈阴性表达。高分化甲状腺滤泡癌PAkt阳性细胞呈散在分布，染色呈黄色。低分化甲状腺滤泡癌PAkt阳性细胞呈弥漫分布，并且呈现异质化表达。10例甲状腺腺瘤中有2例PAkt呈弱阳性表达，10例结节性甲状腺肿组织中未见PAkt表达。PAkt在甲状腺滤泡癌与非滤泡癌组织中的表达差异具有显著性（χ2=43.45，P<0.001）。PTEN蛋白在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤中的阳性表达率分别为100%和80%,均显著高于甲状腺滤泡癌组织25%的表达结果(χ2=15.76、8.25,P<0.01)。PTEN在结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤中的表达差异无显著性(χ2=0.24，P>0.05)。40例甲状腺滤泡癌中32例呈阳性表达。2例结节性甲状腺肿及2例甲状腺腺瘤呈阳性表达。甲状腺滤泡癌VEGF的表达与结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤比较差异有显著性（χ2=20.00、20.00，P<0.001）；结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤中的表达差异无显著性(P>0.05)。

　　2.2  甲状腺滤泡癌组织中PAkt、VEGF的表达与MVD的关系

　　甲状腺滤泡癌组织中，PAkt、VEGF蛋白表达均与MVD值高低相关。PAkt阳性、阴性标本的MVD值分别为29.96±4.21、19.22±1.33，PAkt阳性标本的MVD值高于PAkt阴性标本(t=3.56,P<0.05)。VEGF阳性、阴性甲状腺滤泡癌组织中的MVD值分别为27.88±5.35、21.61±1.12，VEGF阳性甲状腺滤泡癌组织中MVD值亦高于VEGF阴性甲状腺滤泡癌组织(t′=6.12,P<0.05)。甲状腺滤泡癌组织中PAkt与VEGF的表达亦具有相关性（P=0.04）。

　　3  讨论
   
　　PI3K/Akt信号转导通路广泛地存在于细胞中,PI3K激活后的产物与Akt的PH区结合,进一步激活Akt下游的因子,如bcl2家族、S6蛋白激酶等,对细胞周期、凋亡和血管新生等产生调节作用。Akt的活化形式磷酸化蛋白激酶PAkt表达异常在肿瘤细胞恶性增殖、血管新生和转移以及肿瘤对放化疗的拮抗中起着重要作用。
   
　　多年来研究表明,甲状腺滤泡癌与乳头状癌在病因、形成机制、生物学行为及预后上都有很大差别，与乳头状癌相比，滤泡癌更易发生血行转移。在肿瘤细胞发生转移时,肿瘤细胞离开细胞基质进入血循环后,瘤细胞将失去由基质给予的细胞生长及存活的信号,一些瘤细胞失去这种信号仍然能存活,此称为非停泊性生长(AIG)。目前虽然对AIG的机制了解很少,但普遍认为Akt的激活是有利于产生AIG现象的。NAKANISHI等[4]研究显示,AIG的肝内血行转移的肝癌细胞Akt水平很高。齐鲁医学杂志2010年2月第25卷第1期  Med J Qilu, February 2010, Vol.25, No.1植入体内模型中加入阻断PI3K/Akt的阻滞剂可降低肝内血行转移的概率。国内学者检测了172例甲状腺癌中的PI3K/Akt信号通路基因突变，发现52%滤泡癌存在不同程度突变，突变率显著高于甲状腺乳头状癌[5]。PI3K/Akt信号通路基因突变，产生异常蛋白分子，并持续刺激下游分子，导致肿瘤发生和发展。本研究在上述研究的基础上进一步观察滤泡癌病人PI3K/Akt信号转导通路中PAkt表达与其进展及预后关系。结果显示，与甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿相比，PAkt在甲状腺滤泡癌中的表达明显增高，提示PAkt的高表达与甲状腺滤泡癌的发生发展有关。本研究还显示，低分化甲状腺滤泡癌PAkt阳性细胞呈现异质化表达。PI3K/Akt信号通路基因突变，突变常常赋予新的亚克隆更强的生长能力和更强的侵袭能力。肿瘤这种不断的演进又使肿瘤产生异质性。这也可解释本文部分病例中虽有PAkt表达，但未发生局部或全身转移现象。
   
　　人体第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的PTEN通过抑制PI3K激活的蛋白激酶B磷酸化,发挥调控细胞生长及凋亡作用,并参与肿瘤细胞侵袭、转移过程[6]。本研究免疫组化结果显示,PTEN蛋白在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤中的阳性表达率均显著高于甲状腺滤泡癌组织，提示PTEN基因的缺失可能参与甲状腺滤泡癌的发生及侵袭。本研究结果提示，在甲状腺滤泡癌中PTEN的失表达可通过调控PAkt促进肿瘤的侵袭与转移。
   
　　VEGF是具旁分泌功能的生长因子,作用于血管内皮细胞并在生理或病理过程中调节血管内皮细胞增殖与新生血管形成。MVD是反映肿瘤诱导血管生成能力的主要指标,对肿瘤的发生、发展、转移和预后有重要价值。
   
　　本文结果显示，甲状腺滤泡癌组织中VEGF表达与非滤泡癌组织差异有显著性，VEGF阳性标本MVD值高于VEGF阴性标本，表明VEGF在甲状腺滤泡癌的生长和转移中占重要地位。VEGF在甲状腺滤泡癌中高水平表达,以旁分泌的方式刺激甲状腺滤泡癌的血管生成,从而间接地促进甲状腺滤泡癌的发展。本研究相关分析还表明,PAkt阳性标本的MVD值高于PAkt阴性标本，提示PAkt的高表达可能促进了甲状腺滤泡癌新生血管的生成,结合其他学者研究结果,我们推测在甲状腺滤泡癌中可能存在Akt/VEGF通路。在甲状腺滤泡癌中,Akt活化以后,一方面促进细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,增加细胞的运动能力;另一方面可以促进VEGF的表达和分泌,导致肿瘤新血管的生成,增加肿瘤的血供,从而为肿瘤的发展和转移创造条件,两方面相互协调促进肿瘤细胞早期发生转移。而且Akt可能是众多因子调控VEGF表达通路中的关键蛋白,处于调节血管生成的中心环节,因而通过打断PI3K/Akt通路或者抑制Akt活化,有可能抑制肿瘤新生血管生成,从而抑制肿瘤侵袭和转移,此可为甲状腺滤泡癌的治疗提供新的思路及方法。

【参考文献】
  　　[1]KOHLBERGER P D, BREITENECKER F. Modified truecolor computerassisted image analysis versus subjective scoring of estrogen receptor expression in breast cancer: a comparison[J]. Anticancer Res, 1999,19(3B):21892193.

　　[2]WEIDNER N. Intra tumor microvessel density as a prognostic factor in cancer[J]. Am J Pathol, 1995,147(1):919.

　　[3]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报， 2009,45(1):92.

　　[4]NAKANISHI K, SAKAMOTO M, YASUDA J, et al. Critical involvement of the phosphatidylinositol 3kinase PAkt pathway in anchorageindependent growth and hematogeneous intrahepatic metastasis of liver cancer[J]. Cancer Res, 2002,62(10):29712975.

　　[5]WANG Y, HOU P, YU H, et al. High prevalence and mutual exclusivity of genetic alterations in the phosphatidylinositol3kinase/akt pathway in thyroid tumors[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2007,92(6):23872390.

　　[6]谷化平. Survivin和PTEN在鼻咽癌组织表达及临床意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,42(4):331332.