nm23H1和Livin表达对铂类化疗晚期胃癌预后影响

【摘要】  　　目的 探讨 nm23H1和Livin表达对接受铂类药物辅助化疗的晚期胃癌病人预后的影响。方法初治胃癌病人57例，采用奥沙利铂为主的方案进行一线化疗。应用免疫组化方法对胃癌组织进行nm23H1和Livin表达的检测。结果 nm23H1表达阳性率为54.4%(31/57), 与性别、年龄、淋巴结转移、细胞分化、临床分期均无关（P>0.05）; Livin表达阳性率为42.1%(24/57), 与细胞分化有关（χ2=9.344,P<0.05），而与性别、年龄、淋巴结转移、临床分期无关(P>0.05)。nm23H1表达阳性胃癌病人中位肿瘤进展时间显著长于nm23H1 表达阴性病人，差异有统计学意义(χ2=5.310,P<0.05)；而Livin 表达阴性胃癌病人中位肿瘤进展时间显著长于Livin 表达阳性病人，差异有统计学意义(χ2=4.348,P<0.05)。COX多因素分析显示，nm23H1 表达阳性或Livin 表达阴性的病人具有较长的无进展生存期(P<0.05)。结论 nm23H1和Livin的表达与术后晚期胃癌病人接受铂类药物化疗的预后有关, 可以在一定程度上判断术后晚期胃癌病人接受铂类药物化疗的预后情况。

【关键词】  胃肿瘤；药物疗法；nm23H1；Livin；免疫组织化学

　　INFLUENCE OF nm3H1 AND Livin EXPRESSIONS ON PROGNOSIS OF ADVANCED GASTRIC CARCINOMA TREATED WITH PLATINUMBASED CHEMOTHERAPY

　　WANG GUIMEI, ZHANG LIANGMING

　　(Department of Oncology, The Affiliated Yuhuangding Hospital of Qingdao University Medical College, Yantai 264000, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of expressions of nm23H1 and Livin on prognosis of patients with advanced gastric cancer (AGC)  treated with platinumbased chemotherapy. Methods Advanced gastric cancer patients were allotted and they were treated with oxaliplatin as firstline chemotherapy regimen.  Expressions of nm23H1 and Livin in the cancer tissue were detected immunohistochemically. Results The expression rate of nm23H1 was 54.4% (31/57), which was not correlated with gender, age, lymph node metastasis, cell differentiation, and clinical staging (P>0.05). The expression rate of Livin was 42.1% (24/57), which was correlated with cell differentiation, but not with gender, age, lymph node metastasis, and clinical staging. Logrank test showed that time to progression (TTP) in patients with positive expression of nm23H1 was significantly longer than those with negative expression of nm23H1 (χ2=5.310,P<0.05), while the tumorfree median survival time in patients with negative expression of Livin was significantly longer than patients with positive expression of Livin (χ2=4.348,P<0.05). COX multivariate analysis showed that positive expression of nm23H1 or negative expression of Livin was associated with better TTP in patients with AGC (P<0.05).  Conclusion Expressions of nm23H1 and Livin are correlated with the prognosis of patients receiving platinumbased chemotherapy after surgery for AGC, which, in some extent, may be used for predicting the prognosis of these patients.
   
　　［KEY WORDS］ stomach neoplasms; drug therapy; nm23H1; Livin; immunohistochemistry
   
　　铂类药是目前临床治疗晚期胃癌病人的常用药物，如何有效地预测肿瘤对化疗药物的疗效一直是肿瘤临床治疗中的重要问题之一。最近研究显示，nm23H1 低表达与顺铂耐药性有密切关系,主要是与防止细胞核和线粒体 DNA 的损害有关。IAPs是重要的凋亡抑制因子,Livin 作为IAP家族新成员,在一些肿瘤细胞中的特异表达及其重要功能可为肿瘤的发生发展、 诊断、 治疗及预后提供重要的理论依据。本文应用免疫组化方法，研究nm23H1和Livin的表达与晚期胃癌术后病人临床病理参数间的相关性；对晚期胃癌病人给予以铂类药物为主的化疗，评价化疗的效果，研究nm23H1和Livin与化疗预后的关系，以便寻找可以预测化疗效果的指标，为肿瘤的诊断和治疗开辟一条新途径。

　　1  资料和方法

　　1.1  一般资料
   
　　收集青岛大学医学院附属医院、青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院2003年7月—2006年8月间收治的胃癌病人57例，男37例，女20例；年龄33～77岁，中位年龄56岁。依据2002年UICC分期标准进行TNM分期，其中Ⅲa期8例，Ⅲb期31例，Ⅳ期18例。所有病例均为初治胃癌病人。所有病例均接受8～10周期FOLFOX4方案的化疗：奥沙利铂(OXA)85 mg/m2静滴3 h，第1天；亚叶酸钙(LV)200 mg/m2静滴，氟尿嘧啶(5FU)400 mg/m2静脉推注、600 mg/m2 持续静脉滴注22 h，连续2 d，每两周重复。在上述方案一线化疗失败后更换其他非奥铂类方案，同时终止对该病人的研究，观察相应终点指标。化疗前病人血常规、肝肾功能均正常，心电图无明显异常。

　　1.2  nm23H1和Livin蛋白的表达检测
   
　　采用免疫组化抗原热修复技术检测胃癌组织中nm23H1和Livin的表达，抗原修复液为枸橼酸缓冲液（pH 6.0），兔抗人nm23H1和Livin单克隆抗体、PV6000检测试剂盒以及DAB显色剂均购自美国Santa Cruz公司。nm23H1和Livin的检测以已知阳性片作为阳性对照，以PBS作为阴性对照。nm23H1和Livin表达阳性判断：细胞质染为棕黄色。每张切片随机选5个视野,染色细胞占肿瘤细胞比例 ≤20%为阴性, > 20%为阳性。

　　1.3  疗效评价标准
   
　　所有病人均观察其至肿瘤进展时间(TTP)，即从首次化疗开始至证实病情进展的时间。

　　1.4  统计学处理
   
　　应用SPSS 13.0及PPMS 1.5[1]统计学软件进行数据处理，nm23H1和Livin蛋白表达与RFS及临床病理特征之间的关系用χ2检验。采用KaplanMeier生存曲线和logrank检验进行生存分析。与生存的关系采用COX回归模型进行多因素分析，自变量及其赋值方式为：性别（男=0，女=1）、年龄（<60岁=0,≥60岁=1）、细胞分化程度（高分化=0，中分化=1，低分化=2）、临床分期（Ⅲa=0，Ⅲb=1, Ⅳ=2）、淋巴结转移(N0～1=0,N2=1,N3=2), nm23H1表达（阳性=0，阴性=1）及Livin表达（阴性=0，阳性=1）。生存状态的赋值方式为：进展=0，删失=1。所有统计均采用双侧检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。 

　　2  结果

　　2.1  nm23H1和Livin蛋白在胃癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系
   
　　在57 例胃癌组织中31例nm23H1表达阳性，表达阳性率为54.4%，其表达与性别、年龄、细胞分化程度、临床分期和淋巴结转移无关（P>0.05）。57例胃癌组织Livin表达阳性24例，表达阳性率为42.1%，其与性别、年龄、临床分期和淋巴结转移无关（P>0.05）,而与细胞分化程度有关（χ2=9.344,P<0.05）。见表1。表1  胃癌病人nm23H1和Livin蛋白表达与临床病理参数的关系（略）

　　2.2  nm23H1和Livin表达与病人RFS的关系
   
　　随访截止时间为2009年8月。由于失访和研究中止时仍无进展生存的病例有5例，删失数据百分比为8.7%。57例晚期胃癌病人中位无进展生存时间461 d，其中31例nm23H1表达阳性胃癌病人的中位无进展生存时间为490 d，而26例nm23H1表达阴性病人的中位无进展生存时间为295 d，病人RFS的KaplanMeier曲线见图1,logrank检验两者的差异有统计学意义(χ2=5.310,P<0.05)，提示nm23H1阳性的胃癌病人采用铂类化疗无进展生存时间延长。在57例晚期胃癌病人中，33例Livin蛋白表达阴性的病人中位无进展生存时间为479 d，24例Livin蛋白表达阳性病人的中位无进展生存时间为310 d，病人RFS的KaplanMeier曲线见图2, logrank检验其差异有统计学意义(χ2=4.348,P<0.05)，提示Livin蛋白表达阴性的胃癌病人采用铂类药物化疗，其生存时间延长。 
   
　　采用 COX回归模型进行多因素分析，对可能影响胃癌病人预后的因素包括年龄、性别、细胞分化程度、临床分期、淋巴结转移、nm23H1和Livin蛋白表达分析显示，nm23H1蛋白表达阴性是影响预后的独立危险因素（OR=2.502，95%CI=1.272～4.922，P=0.008）；Livin蛋白表达阳性也是影响预后的独立危险因素（OR=2.600，95%CI=1.301～5.196，P=0.007）。

　　3  讨论
   
　　化疗在胃癌的治疗中占有重要地位，多项临床研究证实，化疗与最好的支持治疗相比，可延长晚期胃癌病人的无进展生存期和总生存时间，根治术后胃癌病人进行辅助化疗是降低复发率、延长生存期的主要手段之一。但迄今为止，包括胃癌在内的大多数恶性肿瘤的化疗效果仍不理想。由于病人在药物敏感性方面存在个体差异，相同的化疗方案对不同的肿瘤病人产生不同的疗效。因此，寻找可靠的药物敏感性预测指标指导个体化治疗，对于提高临床用药的有效性和安全性具有重要意义。 
   
　　1988年STEEG 应用差异杂交法,从鼠黑色素瘤细胞系中筛选出 nm23,推测其具有抑制肿瘤细胞转移的能力。随后的很多实验证明，nm23H1 对肿瘤转移能起到一定的抑制作用[24]。但是有些学者研究发现,肿瘤转移与nm23H1蛋白阳性表达率及nm23H1 mRNA 的表达水平未表现出明显的相关性。本研究结果显示，nm23H1的表达与胃癌的淋巴结转移无关，与性别、年龄、临床病理分期、细胞分化也无相关性。最近研究发现, nm23H1 与化疗敏感性有密切关系，nm23H1 低表达与顺铂耐药性有密切关系,膀胱癌病人 nm23H1 的表达水平与对顺铂等药物的敏感性有密切关系[5]。化疗药物对乳癌和黑色素瘤细胞株影响的体外研究显示,171 种临床应用的化疗药物均对 nm23H1 低表达的转移侵袭性细胞株无生长抑制作用,但对顺铂明显增敏[6]。给予相同剂量顺铂,nm23H1 转染组可以明显抑制黑色素瘤荷瘤裸鼠的肺转移[7]。这些研究结果表明， nm23H1除抑制肿瘤转移外,可能还具有参与顺铂抗肿瘤作用的生物学特征[4]。
   
　　目前，nm23H1 表达对胃癌铂类药化疗预后影响的研究较少。铂类药主要与细胞内靶分子 DNA 结合,导致DNA 损害,使其无法转录、复制从而发生经典的 P53 介导的凋亡。nm23H1的过表达可以提高铂类药DNA链内交联的形成,由于线粒体损害是细胞凋亡的早期事件[8],线粒体中铂类药DNA 复合物清除率降低,使铂类药对线粒体 DNA 的损害强于细胞核 DNA 的损害[9]，线粒体膜电位明显降低,引起线粒体通透性转变孔的开启,导致细胞凋亡增强[10]。本文的研究结果显示，57例胃癌组织中nm23H1的表达阳性率为54.4%，经8～10周期FOLFOX4方案的化疗后，nm23H1表达阳性胃癌病人的中位无进展生存期要明显长于nm23H1表达阴性的病人,表明胃癌病人nm23H1 的表达水平与铂类药物的化疗敏感性密切相关。提示nm23H1蛋白的表达可作为判断胃癌铂类药物化疗预后的指标之一。
   
　　Livin是 ASHHAB 等[11]在 2000—2001 年根据 IAP 同源序列发现的一种新的细胞凋亡抑制蛋白，其主要通过阻断凋亡受体及以线粒体为基础的外源性和内源性凋亡途径发挥抑制细胞凋亡的作用[12]。各种肿瘤组织中 Livin 表达与临床病理因素间关系的报道有所不同，有报道 Livin 在分期较晚的胃癌组织表达较高[13]，但其研究例数偏少。本文研究结果显示，57例晚期胃癌病人Livin表达阳性率为42.1%，Livin 在胃癌组织中的表达与分化程度显著相关，Livin 在组织分化较差的胃癌组织表达阳性率高，其原因可能是Livin 在胃癌发生过程中导致凋亡受抑，胃癌细胞表现为过度增殖，提示其在判断胃癌的恶性程度上有一定的意义。
   
　　临床上出现的肿瘤放、化疗不敏感等现象,与恶性肿瘤细胞凋亡机制受损伤引起凋亡耐受有重要关系。LIU等[14]通过体内及体外的研究显示,Livin表达减少能够增加凋亡率,抑制肿瘤生长，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。LOPES等[15]研究显示,胰腺癌组织Livin 过表达,且与对紫杉醇、 阿霉素、 顺铂及氟尿嘧啶的耐药性有相关性。本研究结果显示，经8～10周期以奥沙利铂为主方案化疗后，Livin蛋白表达阴性的胃癌病人的中位无进展生存期要明显高于Livin蛋白表达阳性的病人,表明胃癌病人Livin低表达能增加铂类化疗药物的敏感性，可作为辅助胃癌预后判断的分子标志之一。
   
　　综上所述，nm23H1和Livin的表达状态与胃癌病人铂类药物化疗的预后有关，有可能作为预测铂类药物对晚期胃癌化疗效果的指标，用于指导该类药物的个体化治疗，提高临床治疗的针对性和可预见性。 

【参考文献】
  　　[1]　周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[2]　LEE C S, REDSHAW A, BOAG G. nm23H1 protein immunoreactivity in laryngeal carcinoma[J]. Cancer, 1996,77(11):22462250.

　　[3]　ZAFON C, OBIOLS G, CASTELLVI J, et al. nm23H1 immunoreactivity as a prognostic factor in differentiated thyroid carcinoma[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2001,86(8):39753980.

　　[4]　GALANI E, SGOUROS J, PETROPOULOU C, et al. Correlation of MDR1, nm23H1 and H Sema E gene expression with histopathological findings and clinical outcome in ovarian and breast cancer patients[J]. Anticancer Res, 2002,22(4):22752280.

　　[5]　KAUF FMAN E C, ROBINSON V L, STADLER W M, et al. Metastasis suppression: the evolving role of metastasis suppressor genes for regulating cancer cell growth at the secondary site[J]. Urology, 2003,169(3):11221133.

　　[6]　LIZUKA N, HIROSE K, NOMA T, et al. The nm23H1 gene as a predict or of sensitivity to chemotherapeutic agents in oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer, 1999,81(3):469475.

　　[7]　FERGUSON A W, FLATOW U, MACDONALD N J, et al. Increased sensitivity to cisplatin by nm23transfected tumor cell lines[J]. Cancer Res, 1996,56(13):29312935.

　　[8]　OLIWERO O A, SEMINO C, LOPEZLARRAZA D M, et al. Preferential binding of cisplatin to mit ochondrial DNA of Chinese hamster ovary cells[J]. Mutat Res, 1995,346(4):221230.

　　[9]　OLIWERO OA, CHANG P K, LOPEZLARRAZA D M, et al. Preferential, formation and decreased removal of cisplatinDNA adducts in Chinese hamster ovary cell mitochondrial DNA as compared to nuclear DNA[J]. Mutat Res, 1997,391(12):7986.

　　[10]　KROEMER G, DALLAPORTA B, RESCHERIGON M. The mitochondridal death/life regulation in apoptosis and necrosis[J]. Annu Rev Physiol, 1998,60(1):619642.

　　[11]　ASHHAB Y, ALIAN A, POLLIACK A, et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern[J]. FEBS Lett, 2001,495(12):5660.

　　[12]　KA H, HUNT J S. Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas [J]. Am J Pathol, 2003,163 (2): 413422.

　　[13]　TANABE H, YAGIHASHI A, TSUJI N, et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in nonsmallcell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2004,46(3):299304.

　　[14]　LIU B, HAN M, WEN J K, et al. Livin/MLIAP as a new target for cancer treatment [J]. Cancer Lett, 2007,250(2):168.

　　[15]　LOPES R B, GANGESWARAN R, MCNEISH I A, et al. Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is important for resistance to chemotherapy[J]. Int J Cancer, 2007,120(11):2344.