结肠癌RKO细胞P物质和NK1免疫细胞化学检测

【摘要】  　　目的 探讨P物质及其受体神经激肽1(NK1)在体外培养的结肠癌细胞系RKO 中的表达及免疫细胞化学定位。方法 将RKO细胞接种于提前放入盖玻片的6 孔板进行细胞培养,细胞融合30％时将盖玻片取出进行免疫细胞化学染色。结果 在RKO 细胞系中P物质和NK1呈阳性表达，P物质阳性表达多数位于细胞浆；而NK1阳性表达多数位于细胞浆，少数位于细胞膜。结论 神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。

【关键词】  结肠肿瘤;RKO细胞系;P物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学

　　IMMUNOCYTOCHEMICAL EXPRESSIONS OF SUBSTANCE P AND NEUROKININ1 IN RKO CELLS OF COLON CANCER
］
　　ZHAO LINGLING, CHEN HUA, WANG JIGANG (Qingdao University Medical College, Qingdao, 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the immunoexpressions of substance P and NK1 in RKO cell lines of colon cancer. Methods RKO cells were inoculated on the cover glass and cultured on 6well plate. The cover glass was removed from the plate upon 30% of cell fusion, and the expressions of SP and NK1 of the cultured cells were checked via immunocytochemical staining. Results Positive expressions of substance P and NK1 were mainly found within the cytoplasm of the RKO cells, while a few of NK1 noted on the membrane.  Conclusion The neuroendocrine mechanism might involve in the process of morbidity of colon cancer.
   
　　［KEY WORDS］ colonic neoplasms; RKO cell line; substance P; receptors, neurokinin1; immunocytochemistry
   
　　P物质属于速激肽家族,由PPTA基因编码, 11 个氨基酸组成[1]。它能够特异性结合并激活其受体神经激肽1 (NK1),后者属于7 次跨膜G蛋白耦联受体[2]。NK1 受体激活后,以G 蛋白作为第二信使活化PKC 和MAPK/ERK 通路[23]。近年来研究显示,G蛋白耦联受体介导的信号转导通路参与了某些恶性肿瘤的发病过程。赵双罗等[4]研究显示，从溃疡性结肠炎到癌前病变，再到结肠癌病人血浆中的P物质水平逐级增高。但目前还没有P物质在结肠组织及细胞中表达的报道。NK1在结肠癌组织及细胞可表达[5]。目前对P物质和NK1在结肠 RKO 细胞系中表达情况及定位尚不清楚。本文采用免疫细胞化学染色技术，研究P物质和NK1 在体外培养的RKO 细胞系中的表达情况及免疫细胞化学定位。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
   
　　兔抗人P物质多克隆抗体（1∶200，工作液），购自北京中杉金桥生物公司；兔抗人NK1多克隆抗体(1∶200)购自Millipore公司；正常山羊封闭血清、ElivisionTM试剂盒、DAB显色剂等均购自福州迈新公司；DMEM(低糖)、胰酶(含有0.5 g/L胰酶和0.53 mol/L EDTA)购自Gibco公司；胎牛血清购自PAA公司。人结肠癌RKO细胞系由浙江大学来茂德教授馈赠。

　　1.2  细胞培养
   
　　RKO 细胞培养于含有体积分数0.05 胎牛血清的培养液中,隔天换液。在细胞90%融合时将其接种于预先置入盖玻片的6 孔板中,每孔细胞数约5×105个,置于37 ℃含体积分数0.05的CO2培养箱(美国SHEL LAB公司)中继续培养。在种板第2天,贴壁细胞融合30％将盖玻片取出,置40 g/L甲醛中固定15 min。

　　1.3  免疫细胞化学染色
   
　　采用Elivision 两步反应系统免疫细胞化学染色,所有染色过程在室温下进行。细胞固定标本经PBS 冲洗后先用体积分数0.30 H2O2 孵育15 min,然后滴加非免疫山羊血清30 min 封闭非特异性结合位点。一抗孵育1 h 后,PBS冲洗，后滴加试剂A (增强剂)作用30 min和试剂B (辣根过氧化物酶聚合物)作用20 min,用DAB 显色3 min。最后，苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以正常山羊封闭血清代替一抗做阴性对照。采用乳癌冷冻组织切片作为阳性对照。1.4  结果判定
   
　　所有染色标本采用OLYMPUS BX51 显微镜观察,阳性判断标准参照文献[6]：以低倍镜下见到染色呈明显棕黄色的细胞为阳性。每个标本在高倍镜下(400倍) 随机选取10个视野计数阳性细胞数。

　　1.5  统计学分析
   
　　采用SPSS 16.0及PPMS 1.5[7]软件进行数据处理，结果以±s表示,组间比较采用t检验。

　　2  结果
   
　　RKO细胞贴壁良好,约30%融合,在盖玻片上呈树枝状,细胞呈多角形,界限清晰。经免疫细胞化学染色后,绝大多数细胞中P物质均呈阳性反应,棕黄色颗粒位于细胞浆。NK1在RKO细胞系中定位于细胞浆,少数表达在细胞膜，绝大多数RKO细胞呈强阳性表达。阴性对照未见阳性着色。每高倍视野RKO细胞系中P物质和NK1阳性细胞数分别为(80.17±9.70)、(77.33±8.52)个，二者比较，差异无显著性(t=0.537,P>0.05)。

　　3  讨论
   
　　NK1广泛分布于神经组织和非神经组织[7],参与了包括肿瘤在内的许多疾病过程。各种肿瘤细胞表达的NK1能够高度依赖于P物质的刺激,从而使细胞持续增殖。NK1能引起Ca2+动员,PKC以及MAPK/ERK的活化。NK1活化后以G蛋白为第二信使激活下游信号转导通路,其β和γ亚单位能够活化raf1和ERK1/2而引起细胞的转化,不同条件下这条途径既可引起细胞增殖也可促进细胞的凋亡[78]。本研究显示,P物质和NK1在体外培养的结肠癌细胞系RKO中均呈阳性表达，提示两者可能参与了结肠癌的发生。NK1受体在结肠癌细胞高表达与ROSSO等[5]的研究结果相一致。由于P物质及NK1与神经内分泌系统密切相关,提示神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。P物质能够上调NK1的表达水平[10],RKO细胞系中P物质阳性表达也提示NK1高水平表达。SINGH等[11]认为,P物质刺激部分癌细胞的生长作用可能是通过它和一些细胞因子(IL21、IL26和SCF等)的共同作用而引起的。本文研究结果表明,RKO结肠癌细胞本身存在P物质的高表达,这提示P物质以自分泌方式刺激肿瘤细胞的生长。另外,PETEL等[12]报道在细胞培养上清液中存在P物质,这表明P物质也可能通过旁分泌方式上调并激活细胞膜上NK1受体,从而激活下游信号转导通路引起肿瘤细胞的增殖。考虑到两种方式同时参与了P物质对结肠癌生长的影响过程,我们认为阻断其中任何一种方式都可能起到抑制肿瘤生长的作用。
   
　　免疫化学方法简单实用,用该法标记特定类型的肿瘤标志物一直是重要的辅助诊断手段[1314]。本研究免疫细胞化学染色结果证明P物质和NK1两种神经内分泌指标在RKO细胞系高表达,这为临床上具有该细胞系特点的结肠癌提供了一种新的简单可靠的诊断指标。
   
　　综上所述,本研究结果不但提供了结肠癌RKO细胞系的一种新特性,也为新的抗肿瘤药物研究提供了理论基础。进一步研究P物质及其受体NK1与RKO细胞系的关系,以阐明二者在该类型结肠癌中的作用,对研究结肠癌的发生机制有着新的意义，并可能为结肠癌的临床诊断提供新的指标。

【参考文献】
  　　[1]　LEEMAN S E, FERGUSON S L. Substance P: an historical perspective [J]. Neuropeptides, 2000,34(5):249254.

　　[2]　BEAUJOUAN J C, TORRENS Y, SAFFROY M, et al. A 25 year adventure in the field of tachykinins[J]. Peptides, 2004,25(3):339357.

　　[3]　LUO W, SHARIF T R, SHARIF M. Substance Pinducedmitogenesis in human astrocytoma cells correlates with activation of the mitogenactivated protein kinase signaling pathway[J]. Cancer Res, 1996,56(21):49834991.

　　[4]　赵双罗,潘秀峰,李素晓,等. 结肠癌患者血浆脑肠肽水平改变的意义[J]. Natl Med J Chin, 1997, 77(10):796.

　　[5]　ROSSO M, ROBLESFRAS M J, COVEAS R, et al. NK1 receptor is expressed in human primary gastric and colon adenocarcinomas and is involved in the antitumor action of L733,060 and the mitogenic action of substance P on human gastrointestinal cancer cell lines[J]. Tumor Biol, 2008,29(11):245254.

　　[6]　DOMOTOR A, PEIDL Z, VINCZE A, et al. Immunohistochemical distribution of vanilloid receptor, calcitoningene related peptide and substance P in gastrointestinal mucosa of patients with different gastrointestinal disorders[J]. Inflammo pharmacology, 2005,13(123):161177.

　　[7]　RAMESHWAR P, GASCDN P. Hematopoietic modulation by the tachykinins[J]. Acta Haematol, 1997,98(2):5964.

　　[8]　NOWICKI M, OSTALSKA2NOWICKA D. The significance of substance P in physiological and malignant haematopoiesis[J]. J Clin Pathol, 2007,60(7):749755.

　　[9]　HORSTMANN S, KAHL E P J, BORASIO G D. Inhibitors of p38 mitogenactivated protein kinase promote neuronal survival in vitro[J]. J Neurosci Res, 1998,52(4):483490.

　　[10]　LEE C M, JOHNSON C G, STAUDERMAN K A, et al. Functional substance P receptors on a human astrocytoma cell line (U2373 MG)[J]. B rain Res, 1989,488(1/2):328331.

　　[11]　SINGH D, JOSHI D D, HAMEED M, et al. Increased expression of preprotachykinin1 and neurokinin receptors in human breast cancer cells: implications for bone marrow metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(1):388393.

　　[12]　PATEL H J, RAMKISSOON S H, PATEL P S, et al. Transformation of breast cells by truncated neurokinin1 receptor is secondary to activation by preprotachykininA peptides[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(48):1743617441.

　　[13]　王继纲,陈桦. 乳癌T47D细胞P物质和NK1 的免疫细胞化学检测[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(3):218220.

　　[14]　谭雪梅,项锋钢. Elf21在胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(2):142144.