神经调节素对缺血性脑损伤大鼠COX2表达的影响

【摘要】  目的 探讨神经调节素对大鼠局灶性脑缺血再灌注后COX2表达的影响。方法 实验分为假手术组、对照组和治疗组。采用线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞再灌注(MCAOR)模型，治疗组给予神经调节素干预治疗。于缺血1 h再灌注6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d，对照组和治疗组采用免疫组化和原位杂交技术分别检测COX2蛋白及COX2 mRNA的表达。结果 假手术组脑组织可见到少量COX2阳性细胞。对照组缺血再灌注6 h后COX2阳性细胞数开始增加，再灌注2 d后达高峰，然后阳性细胞逐渐减少，至14 d仍有表达。治疗组COX2阳性细胞数相对较少，变化规律与对照组相似，同一时间点比较，治疗组均显著低于对照组(t=2.558～6.795,P<0.05)。结论 神经调节素可能通过抑制脑缺血再灌注后COX2的表达，发挥其神经保护作用。

【关键词】  神经调节素;脑缺血;再灌注损伤;环氧化酶2

　THE EFFECT OF NEUREGULIN ON THE EXPRESSION OF COX2 AFTER CEREBRAL ISCHEMIC INJURY IN RATS WANG SUPING, WANG SHOUBIAO (Department of Anatomy, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); Objective To study the effects of neuregulin on the expression of COX2 after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats. Methods The trial was divided into three groups as shamoperation, control and treatment. A rat model of middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAOR) was created using filament method. Neuregulin intervention therapy was offered to the rats in the treatment group. The expression of COX2 was determined by immunohistochemical technique and that of COX2 mRNA by in situ hybridization after onehour ischemia and reperfusion for 6 and 12 hours, and 1, 2, 3, 7 and 14 days. Results A few positive COX2 cells could be seen in brain tissue of the shamoperation group. In the control, the positive COX2 started to increase when reperfusion for 6 hours, and reached the peak at 24 hours, and then the positive cells decreased gradually after 2 days, but the expression still could be found on day 14. In the treatment, the positive COX2 cells were relatively less, the rule of changes was similar to that of the control, as compared with the same time point, the positive COX2 cells were fewer in the treatment than that in the control. Conclusion Neuroprotective effect of neuregulin is likely through inhibition of the expression of COX2 after cerebral ischemic reperfusion injury.

　　[KEY WORDS] neuregulin; brain ischemia; reperfusion injury; cyclooxygenase 2

　　研究表明，环氧化酶2(COX2)及其代谢产物参与脑缺血再灌注损伤，COX2 mRNA和蛋白在大鼠短暂性局灶性脑缺血后表达升高，应用COX2的特异性抑制剂NS398可显著减小梗死体积[1]。神经调节素1β (NRG1β)在体内、外的中枢神经系统中属抗炎物质，无论内源性还是外源性的NRG1β都具有神经保护作用，但这一保护反应只对再灌注脑损伤的功能修复发挥作用，对单纯性脑缺血损伤的作用则不显著[24]。本研究试图应用大脑中动脉阻塞再灌注(MCAOR)动物模型，观察神经调节素对COX2表达的影响，探讨其在MCAOR过程中的抗炎作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组及模型制备

　　成年健康雄性Wistar大鼠105只，体质量为230～250 g，SPF级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供(SCXK(鲁)20070010)。实验前将大鼠置于实验室适应环境1周，自由进食、饮水，室温(23±2)℃，自然光照。术前禁食12 h。随机选择5只为假手术组，插线进入颈内动脉10 mm即刻退出。其余100只大鼠应用线栓法经左侧颈外颈内动脉插线建立MCAOR模型[5]。术中和术后用恒温电热毯保持大鼠肛温36～37 ℃。术后2 h出现左侧HORNER征、提尾时右前肢屈曲、爬行时向右侧划圈者为有效模型。将成功的MCAOR动物模型64只纳入统计范围，随机分为对照组和治疗组各32只，每组再分为缺血1 h再灌注6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d等共7个亚组，每组4只。

　　1.2 干预治疗

　　应用0.1 mol/L PBS将重组人NRG1β(R & D Systems, Inc, Catalog number: 396HB)溶解稀释成15 g/L溶液，治疗组动物于缺血1 h拔出线栓后，即刻采用微量注射器经颈外动脉给予15 g/L的NRG1β 5 μL，然后结扎颈外动脉残端，放开颈总和颈内动脉的动脉夹恢复血流再灌注。对照组和假手术组同步注射0.1 mol/L的PBS溶液5 μL。

　　1.3 标本采集

　　对照组和治疗组均在规定的时间点取材，假手术组于术后24 h取材。以100 g/L水合氯醛麻醉，生理盐水200 mL和40 g/L多聚甲醛200 mL经心脏灌注固定，断头暴露脑组织，于前囟前2 mm至前囟后3 mm之间取脑。置于40 g/L多聚甲醛(含1∶5 000的DEPC)后固定2 h，蒸馏水(经1∶5 000的DEPC处理)浸泡4 h，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。连续冠状切片，切片厚度5 μm，备用。

　　1.4 免疫组化和原位杂交检测

　　COX2免疫组化染色和COX2 mRNA原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德生物公司。按照试剂盒说明书操作，光镜下观察，细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。部分切片不加一抗和探针，以PBS替代染色，不出现阳性反应。每个标本在高倍镜(400倍)下随机观察缺血周围区4个不重叠的视野，计数阳性细胞。

　　1.5 统计学处理

　　计量资料采用±s表示，组间比较采用方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 脑缺血再灌注后COX2蛋白表达

　　假手术组和对照组非缺血侧脑组织可见到少量COX2阳性细胞。 对照组MCAOR后6 h的COX2阳性细胞数逐渐增加，至再灌注2 d达高峰，2 d后逐渐减少，至14 d时仍有表达，各相邻时间点比较差异有显著性(F=5.70～5.79,q=5.07～6.80,P<0.05)。治疗组COX2阳性细胞数相对较少，变化规律与对照组相似，与对照组同一时间点相比较差异有显著意义(t=3.212～3.842,P<0.05)。见表1。

　　2.2 脑缺血再灌注后COX2 mRNA表达

　　假手术组和对照组非缺血侧脑组织的COX2 mRNA弱表达。MCAOR后6 h的COX2 mRNA表达逐渐增强，再灌注12 h达高峰，持续2～3 d，然后开始下降，至14 d时仍有表达，各相邻时间点比较差异有显著性(F=5.71～5.77，q=4.60～6.33，P<0.05)。治疗组COX2 mRNA阳性细胞数相对较少，变化规律与对照组相似，与对照组同一时间点相比差异有显著性(t=2.558～6.795,P<0.05)。见表1。表1 各组脑缺血再灌注后COX2表达比较

　　3 讨 论

　　COX2是前列腺素合成酶的限速酶，引起炎症反应和介导炎症细胞毒性。脑缺血是由在组织损伤过程中起重要作用的炎症反应引起的[6]。有研究显示，在大鼠短暂性局灶性脑缺血模型中，缺血后6 h，COX2 mRNA在缺血侧半球即出现表达上调，在12～24 h达到高峰，48 h开始下降，同时显示COX2蛋白水平在缺血6 h后即开始升高，并分布于缺血周围区[1]。本研究结果也显示，MCAOR后6 h的COX2 mRNA阳性细胞数逐渐增加，至再灌注12 h达高峰，持续2～3 d，然后开始下降，至14 d时仍有表达，与文献报道的结果一致[7]。COX2蛋白表达达到高峰的时间在脑缺血再灌注后2 d，较COX2 mRNA延迟，持续时间短且下降速度快，出现暂时性COX2 mRNA与蛋白分离现象，这可能是由于缺血低氧后激活一氧化氮(NO)系统，高水平NO可能通过使COX2亚硝酰基化或增加蛋白的降解而降低COX2蛋白的水平[8]。

　　NRG1β被认为与神经元的生存和功能有关，可能通过多种机制，如调节两种抗凋亡分子Bcl2和Bclw的表达，抑制单核细胞浸润和星形胶质细胞活化，抑制血管内皮上的单核黏附分子和趋化因子的产生，诱导巨噬细胞凋亡或促进细胞存活的磷脂酰肌醇3激酶Akt信号转导通路等发挥神经保护作用[9]。本文研究结果显示，应用神经调节素后，COX2 mRNA及其蛋白的表达变化规律与对照组相似，但其表达数量明显减少，同一时间点相比，差异均有显著性，说明神经调节素能够减少MCAOR后脑组织中COX2 mRNA及其蛋白的表达。因此，我们推断神经调节素对缺血神经元的保护作用还可通过选择性地抑制COX2的表达这一途径来实现，其具体作用机制有待进一步研究。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5

【参考文献】
  　　[1]NOGAWA S, ZHANG F, ROSS M E, et al. Cyclooxygenase2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage[J]. J Neurosci, 1997,17(8):27462755.

　　[2]XU Z, FORD G D, CROSLAN D R, et al. Neuroprotection by neuregulin1 following focal stroke is associated with the attenuation of ischemiainduced proinflammatory and stress gene expression[J]. Neurobiol Dis, 2005,19(3):461470.

　　[3]LI Q, LI Z, MEI YW, GUO Y L. Neuregulin attenuated cerebral ischemiareperfusion injury via inhibiting apoptosis and upregulating aquaporin4[J]. Neuroscience Letters, 2008,443(3):155159.

　　[4]王涛,杜芳,郭云良,等. 神经调节素对小鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用及可能的机制[J]. 解剖学报, 2008,39(1):3741.

　　[5]陈红兵,王鲁民,陈燕,等. 大鼠大脑中动脉缺血再灌流模型的建立和缺血半影区的界定[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(4):470473.

　　[6]ZHANG R L, CHOPP M, JIANG N, et al. Antiintercellular adhesion molecule1 antibody reduces ischemic cell damage after transient but not permanent middle cerebral artery occlusion in the Wistar rat[J]. Stroke, 1995,26(8): 14381443.

　　[7]YIN W, BADR A E, MYCHASKIW G, et al. Down regulation of COX2 is involved in hyperbaric oxygen treatment in a rat transient focal cerebral ischemia model[J]. Brain Res, 2002,926(12):165171.

　　[8]HIROTSUGU O, OSAMU I, RICHARD J R, et al. Role of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase2 in endotoxinInduced cerebral hyperemia[J]. Stroke, 1998,29(6):12091218.

　　[9]LI B S, MA W, JAFFE H, et al. Cyclindependent kinase5 is involved in neuregulin dependent activation of phosphatidylinositol 3kinase and Akt activity mediating neuronal survival[J]. J Biol Chem, 2003,278(37):3570235709.