P物质和神经激肽1在乳癌组织的表达及意义

【摘要】  目的 研究P物质及其受体神经激肽1(NK1)在乳癌组织表达及意义。方法 采用免疫组织化学染色法检测P物质及NK1在乳癌以及导管上皮非典型增生、纤维腺瘤、腺病及导管内乳头状瘤等良性病变组织表达。结果 P物质和NK1在乳癌组织阳性表达率分别为74.76%(77/103)和87.38%(90/103)，二者表达水平与乳癌组织学分级呈正相关(r=0.253、0.228，P<0.05)。P物质和NK1在5例乳腺导管上皮不典型增生组织均呈阳性，而在5例纤维腺瘤及6例腺病中均呈阴性。3例导管内乳头状瘤均未见P物质表达，而2例存在NK1的阳性表达。结论 P物质及NK1参与了乳癌的发病过程，为乳癌诊断提供了新的可能的免疫组化指标。

【关键词】  乳腺肿瘤;P物质;受体,神经激肽1;免疫组织化学

　EXPRESSIONS AND SIGNIFICANCE OF SUBSTANCE P AND NEUROKININ1 IN BREAST CARCINOMA WANG JIGANG, GAO HAN, CHEN HUA (Department of Pathology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); Objective To investigate the expressions of substance P (SP) and neurokinin1 (NK1) in breast cancer andevaluate their clinical significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of SP and NK1 in breast carcinoma, and in benign lesions such as atypical hyperplasia in ductal epithelium (AHDE), fibroadenoma, adenosis, and intraductal papilloma (IDP). Results The expression rate of SP and NK1 in breast cancer was 74.76% (77/103) and 87.38%(90/103), respectively, the above two expressions were positively correlated with histological grading (r=0.523, 0.228;P<0.05). The expressions of SP and NK1 were positive in five cases of AHDE, but negative in five cases with fibroadenoma and six withadenosis. In three cases with IDP, no SP was found, but two were observed with NK1 expression. Conclusion Substance P and neurokinin1 involve in the development of breast carcinoma, which provides new and potential immunohistochemical markers for the diagnosis of breast cancer.

　　[KEY WORDS] breast neoplasms; substance P; receptors, neurokinin1; immunohistochemistry

　　近来研究发现，P物质可能参与了某些恶性肿瘤发病过程[1]。P物质由PPTA基因编码产生，广泛分布于人体内各种组织中[2]。药理学研究证实，P物质能够同G蛋白耦联受体神经激肽1(NK1)特异性结合[34]。在人类已发现有两种亚型NK1：全长型NK1(NK1FL)和截短型NK1(NK1Tr，其胞浆段比全长型少100个氨基酸残基)[5]。P物质能够通过激活NK1来调节细胞的有丝分裂过程[1], 并且某些种类的NK1拮抗剂能够抑制乳癌细胞的生长[6]。已有研究结果显示，在某些肿瘤组织及细胞中存在P物质及NK1的表达[1,7]，但目前对P物质及NK1在乳癌组织中的表达特点及其临床病理意义尚不清楚。本研究旨在通过免疫组化法探讨P物质及NK1在乳癌中的表达特点及其临床意义，为临床诊断及治疗该病提供理论基础。 现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 组织标本的收集

　　本实验所需乳癌组织均取自青岛市市立医院2006—2007年外科手术切除标本。所有病人术前均未接受放疗或(和)化疗。乳癌的诊断及分级标准参照《ROSAI&ACKERMAN外科病理学》[8]。选取浸润性导管癌89例，浸润性小叶癌14例;其中高分化28例，中分化36 例，低分化39例;有淋巴结转移者45例，无淋巴结转移者58例。同时，选取其他类型良性肿瘤19例，其中纤维腺瘤6例，腺病5例，导管内乳头状瘤3例，非典型增生5例。

　　1.2 主要试剂

　　兔抗人P物质多抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司(使用浓度为1∶50)，兔抗人NK1多抗购自美国Millipore公司(特异性结合NK1羧基段393～407位氨基酸，使用浓度为1∶700)。ElivisionTM试剂盒、枸橼酸抗原修复液(pH 6.0)、非免疫山羊封闭血清及DAB显色剂等均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.3 免疫组化染色

　　所有新鲜标本取材后立即于箱式冷冻切片机内行7 μm厚连续切片。将所有冷冻切片均于4 ℃的冷丙酮溶液中固定15 min，室温下晾干30 min，然后置于-20 ℃冰箱中备用。其余组织置于40 g/L中性甲醛中固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，80 ℃烤片30 min。免疫组化染色采用ElivisionTM两步法进行。P物质的免疫组化染色采用冷冻切片，NK1的免疫组化染色采用石蜡切片。NK1的染色须进行抗原修复(用微波修复，600 W，5 min，共2次)。 PBS代替一抗作为阴性对照，采用正常小肠黏膜作为P物质染色的阳性对照[9]，采用胰腺癌组织作为NK1染色的阳性对照[10]。

　　1.4 染色结果的判定

　　所有切片用Olympus BX51显微镜观察，只有在低倍镜下胞浆或胞膜被染成棕黄色者判定为阳性。根据文献[1011]对染色结果进行判定并计算免疫反应分数(IRS)，然后对结果进行分级。连续观察5个高倍视野，同时计算阳性细胞百分比(0～4分)和染色强度(0～3分)，二者相乘为IRS，IRS 0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为()，9～12分为()。计算P物质阳性细胞百分比时，阴性为0分，<5%为1分，5%～10%为2分, 11%～30%为3分, >30%为4分;计算NK1阳性细胞百分比时，<10%为1分，10%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分;观察着色强度时，无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 10.0及PPMS 1.5[12]统计学软件，采用Spearman等级相关分析进行统计学检验。

　　2 结 果

　　2.1 P物质与NK1在乳癌组织中的表达

　　P物质阳性染色位于乳癌细胞胞浆，阳性细胞呈散在分布。NK1阳性染色位于乳癌细胞胞膜和胞浆，阳性细胞呈弥漫分布。103例乳癌组织标本中，P物质染色阳性77例(74.76%)，NK1染色阳性90例(87.38%)，在阳性病例中，二者的染色强度与乳癌的组织学分级呈正相关(r=0.253、0.228，P<0.05)，而与病理类型及有无淋巴结转移无相关性(r=0.052～0.105，P>0.05)。见表1。

　　2.2 P物质和NK1在其他良性肿瘤组织的表达

　　在非典型增生组织中(包括单发或在乳癌中伴发)，P物质和NK1均呈阳性表达，阳性部位位于胞浆。同乳癌组织相比，二者在非典型增生组织着色强度明显减弱。在5例乳腺纤维腺瘤和6例乳腺腺病组织中，P物质和NK1均呈阴性表达。3例导管内乳头状瘤中，2例NK1呈弱阳性表达，棕黄色颗粒位于肿瘤细胞胞浆;而P物质均呈阴性。　表1 P物质和NK1表达与乳癌临床病理特征关系(例)临床病理特征nP物质

　　3 讨 论

　　本研究结果显示，P物质和其受体NK1在乳癌组织均呈阳性表达，这同SINGH等[6]的研究结果相一致。P物质能够特异性结合NK1，然后在细胞膜的胞浆侧诱导产生多种蛋白复合物，如NK1、βarrestin、src和 ERK1/2。ERK1/2能够进入细胞核激活基因转录，从而诱导细胞增殖，并使细胞免于凋亡[13]。此外，细胞膜表面的NK1受体活化后能够活化G蛋白，其下游信号分子能同其他一些信号转导过程相互交联，从而共同促进肿瘤细胞的增殖[14]。P物质属于一种神经递质，它能够增加肿瘤组织中的神经纤维的数量，增强肿瘤组织中的信号传递，这有助于肿瘤的生长及转移。本研究乳癌组织P物质及NK1的表达提示神经内分泌机制可能参与了乳癌发病过程，P物质可能是神经内分泌系统同乳癌之间的“桥梁”。如果用特异性的NK1拮抗剂阻断NK1受体，可能会抑制肿瘤细胞的增殖。实际上，目前体外细胞培养实验已发现，一些种类的NK1受体拮抗剂能够减缓乳癌细胞的增殖，但不能完全抑制其生长[13]。 值得注意的是本研究标记的是NK1FL亚型的受体而非NK1Tr，由于目前尚未有针对NK1Tr的抗体，所以还不能用免疫组化法检测NK1Tr亚型的表达与否。

　　尽管一些癌前病变例如导管上皮的不典型增生仅被认为是浸润癌发生之前的恶变过程，但在这类病变中仍存在P物质和NK1的表达，而在纤维腺瘤以及腺病等病变中二者均呈阴性。已有的研究阐明了PPTA基因同NK1的相互影响关系[6]，所以我们推测在癌前病变阶段，病变部位的炎细胞产生的P物质与增生的上皮细胞表面的NK1相结合，NK1活化后诱导增生的导管上皮细胞本身产生P物质。NK1与P物质相互诱导产生，二者表达量的逐渐增多使这些异型细胞获得更加恶性的生物学行为。在乳腺导管内乳头状瘤组织P物质和NK1均呈阳性表达，其原因尚不清楚，可能是导管内乳头状瘤常常伴发不同程度的不典型性增生[8]。目前国内外尚未见P物质及NK1在乳腺良性病组织免疫组化研究相关报道，尚需加大样本量进一步研究，以探讨二者在乳腺良性病变组织表达特点及意义。

　　综上所述，神经内分泌机制参与了乳癌的发病过程，本研究结果为乳癌的诊断和治疗提供了理论基础。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5

【参考文献】
  　[1]ESTEBAN F, MUOZ M, GONZLEZMOLES M A, et al. A role for substance P in cancer promotion and progression: a mechanism to counteract intracellular death signals following oncogene activation or DNA damage[J]. Cancer Metastasis Rev, 2006,25(1):137145.

　　[2]PINTO F M, ALMEIDA T A, HERNANDEZ M, et al.mRNA expression of tachykinins and tachykinin receptors in different human tissues[J]. Eur J Pharmacol, 2004,494(2/3):233239.

　　[3]BEAUJOUAN J C, TORRENS Y, SAFFROY M, et al. A 25 year adventure in the field of tachykinins[J]. Peptides, 2004,25(3): 339357.

　　[4]PENNEFATHER J N, LECCI A, CANDENAS M L, et al. Tachykinins and tachykinin receptors:a growing family[J]. Life Sci, 2004,74(12):14451463.

　　[5]FONG T M, ANDERSON S A, YU H, et al. Differential activation of intracellular effector by two isoforms of human neurokininⅠ receptor[J]. Mol Pharmacol, 1992,41(1):2430.

　　[6]SINGH D, JOSHI D D, HAMEED M, et al. Increased expression of preprotachykininⅠ and neurokinin receptors in human breast cancer cells: implications for bone marrow metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(1):388393.

　　[7]王继纲,陈桦. 乳癌T47D细胞P物质和NK1的免疫细胞化学检测[J]. 齐鲁医学杂志, 2009, 24(3):218220.

　　[8]罗塞. 回允中主译. ROSAI&ACKERMAN外科病理学[M]. 9版. 北京:北京大学医学出版社, 2006:17631876.

　　[9]GREENWOOD B, DOOLITTLE T, SEE N A, et al. Effects of substance P and vasoactive intestinal polypeptide on contractile activity and epithelial transport in the ferret jejunum[J]. Gastroenterology, 1990,98(6):15091517.

　　[10]SCHULZ S, STUMM R, ROCKEN C, et al. Immunolocalization of fulllength NK1 tachykinin receptors in human tumors[J]. J Histochem Cytochem, 2006,54(9):10151020.

　　[11]BURKHARDT M, MAYORDOMO E, WINZER K J, et al. Cytoplasmic overexpression of ALCAM is prognostic of disease progression in breast cancer[J]. J Clin Pathol, 2006,59(4):403409.

　　[12]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[13]DEFEA K A, VAUGHN Z D, O’BRYAN E M, et al. The proliferative and antiapoptotic effects of substance P are facilitated by formation of a betaarrestindependent scaffolding complex[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(20):1108611091.

　　[14]PAYAN D G, BREWSTER D R, MISSIRIANBASTIAN A, et al. Substance P recognition by a subset of human T lymphocytes[J]. J Clin Invest, 1984,74(4):15321539.