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【摘要】 目的 研究海洋刺参多糖(SJAMP)对人宫颈癌细胞系HeLa细胞周期影响并探讨其作用机制。方法 实验分为对照组(不用SJAMP)及1.6、3.2、6.4 g/L不同剂量SJAMP组。应用免疫细胞化学法分别检测各组SJAMP对增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期抑制蛋白Mdm2表达的影响;流式细胞仪检测不同浓度SJAMP对HeLa细胞周期的影响。结果 与对照组相比较，1.6、3.2和6.4 g/L SJAMP组均能抑制PCNA和Mdm2的表达(F=209.02～951.11，q=18.97～74.55，P<0.05)，且具有一定的浓度依赖和时间依赖关系。经SJAMP处理的HeLa细胞发生G1期阻滞，对照组及1.6、3.2、6.4 g/L SJAMP组细胞的凋亡率分别为0.25%、4.32%、11.36%和30.04%，差异有显著性(F=26.95～259.21,q=3.34～36.36,P<0.05)。结论 SJAMP对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用。其机制可能是SJAMP降低PCNA和Mdm2蛋白的异常表达，使细胞周期发生G1期阻滞，从而起到抑制细胞增殖的作用。
【关键词】 刺参属(动物);多糖类;宫颈肿瘤;HeLa细胞;细胞周期
EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS ACIDIC MUCOPOLYSACCHARIDE ON CELL CYCLE OF HeLa CELLS AND ITS MECHANISM NIU JUANJUAN, SONG YANG (Department of Nutrition, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); Objective To investigate the effect of Stichopus japonicus acidic mucopolysaccharide (SJAMP) on cell cycle of HeLa cells and its mechanisms. Methods HeLa cells were exposed to various concentrations of SJAMP for certain time. Immunocytochemical stain was used to detect the expressions of PCNA and Mdm2 protein. Flow cytometric analysis was performed for cell cycle progression. Results A dosedependent as well as timedependent growth inhibition was observed in SJAMPtreated HeLa cells, and associated with an increase in G1 arrest, the rate of APO was 0.25%,4.32%,11.36% and 30.04%, respectively; different concentrations of SJAMP decreased the abnormal expression of Mdm2 gene and strongly decreased the expression ofPCNA (F=209.02-951.11,q=18.97-74.55,P<0.05). Conclusion SJAMP has an inhibitory action on proliferation of HeLa cells and its mechanism might be related to lowering abnormal expressions of PCNA and Mdm2, blocking cell cycle, resulting in the inhibition of cell multiplication.
[KEY WORDS] stichopus; polysaccharides; uterine cervical neoplasms; HeLa cells; cell cycle
海洋刺参多糖(SJAMP)为海洋腔肠类动物体内富含的一类天然海洋活性物质，属多糖类物质，其单糖组成恒定，结构简单，容易被吸收。初步研究证实，刺参黏多糖具有广谱的抗肿瘤活性，能抑制多种恶性肿瘤细胞增殖，诱导细胞分化，而且其对细胞的生长抑制作用具有一定的选择性，能选择性作用于病人体内的大量幼稚细胞，使其变性、坏死，而对成熟细胞则无明显作用[14]。肿瘤细胞的性质类似于幼稚细胞，因此SJAMP进入人体后将可能只选择性作用于异倍体的肿瘤细胞，而对正常的二倍体细胞无作用或作用很弱，从而降低了肿瘤治疗的副作用。此外，研究表明，SJAMP有增强免疫功能的作用[56]。近年来一些研究表明，SJAMP可能通过调节细胞信号转导、调控细胞周期控制基因、癌基因、抑癌基因的表达参与细胞增殖和凋亡等重要生命活动，发挥抗癌功能，但目前有关SJAMP的抗癌机制尚不清楚，我国的研究报道更有限。本研究探讨了不同浓度SJAMP对HeLa细胞周期分布的影响，同时进一步证实其对增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期抑制蛋白Mdm2表达的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
SJAMP由中国海洋大学医药学院提取，纯度99.5%。人宫颈癌细胞HeLa细胞系，购于中国科学院上海细胞库。
1.2 细胞培养
将HeLa细胞常规培养于含有体积分数0.10胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养。
1.3 Mdm2、PCNA蛋白的免疫组化检测
HeLa细胞培养于不含SJAMP(对照组)及含不同浓度SJAMP(1.6、3.2、6.4 g/L SJAMP组)的培养液中，分别于培养的1～3 d消化离心收集细胞，用PBS液洗涤2次，重悬于PBS中制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×108/L，将上述细胞悬液加入有围孔的载玻片上，每孔20 pL。室温下晾干，置于冷丙酮溶液-20 ℃下固定5 min，取出自然干燥后于-20 ℃保存。按试剂盒说明书分别进行Mdm2、PCNA免疫细胞化学法检测。采用UiDAS 21图像分析系统进行吸光度(A)值测定，每个标本测100～120个细胞，取其均值。
1.4 细胞周期测定
取不同浓度SJAMP与细胞共同孵育72 h后(每个样本细胞密度>109/L)，用胰酶消化，900 r/min离心5 min，弃上清，调整细胞密度为109/L，取1 mL细胞悬液，用PBS洗3次，加入200 μL PI染液(PI终浓度为50 ng/L，RNase A终浓度为20 ng/L)，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪分析细胞周期，以上实验重复3次。
1.5 统计学处理
采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[7]软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较使用q检验;两组比较采用t检验。
2 结 果
2.1 SJAMP对HeLa细胞Mdm2、PCNA蛋白表达的影响
2.1.1 Mdm2蛋白的表达 Mdm2蛋白阳性细胞呈棕褐色。Mdm2蛋白的表达与对照组相比，各组均有降低(F=302.91～805.76，q=18.97～68.27，P<0.05)，并且随着剂量的增加，Mdm2蛋白的表达降低(q=8.82～68.27,P<0.05)。随着时间的增加，Mdm2蛋白的表达明显降低(F=96.97,q=5.43～19.11,P<0.05)。见表1。
2.1.2 PCNA蛋白的表达 PCNA蛋白阳性细胞呈棕褐色。与对照组相比，各组PCNA蛋白的表达均有降低(F=209.02～951.11,q=34.76～74.55，P<0.05)，并且随着剂量的增加，PCNA蛋白的表达降低(q=8.14～74.55,P<0.05)。随着时间的增加，PCNA的表达降低(F=131.06,q=4.29～21.62,P<0.05)。见表2。
2.2 细胞周期测定
随着SJAMP作用时间的延长，作用浓度的增加，其对HeLa细胞周期分布的影响越来越强。与对照组相比，1.6、3.2和6.4 g/L SJAMP组的细胞周期分布发生了显著变化，细胞被阻滞在G0/G1期，其中6.4 g/L SJAMP组G0/G1期细胞达到68%以上，而其他各期细胞均显著减少(F=26.95～172.24,q=3.34～29.38,P<0.05)。各组凋亡率差异有显著性(F=259.21,q=4.97～36.36,P<0.05)。见表3。表1 不同浓度SJAMP对HeLa细胞Mdm2表达的影响 表2 不同浓度SJAMP对HeLa细胞PCNA蛋白表达的影响表3 不同浓度SJAMP对HeLa细胞周期分布的影响(n=3,±s)组 别G0/G1G2/MS凋亡率(
3 讨 论
肿瘤产生的本质是细胞增殖的调节失控。已有一些实验研究结果表明，SJAMP可能是一种广谱抗肿瘤物质，对多种肿瘤细胞系具有良好的抑制其增殖的作用，包括对雌激素受体阳性和雌激素受体阴性的人乳癌细胞、宫颈癌细胞系、前列腺癌细胞系和HepG2肝癌细胞系。肿瘤细胞增殖的调节失控，归结点在于其细胞周期的调控异常。在细胞周期中，G1SG2M期相互转换过程有多个关卡调节着细胞周期的演变速度。本研究使用流式细胞仪检测技术观察了不同浓度SJAMP作用对HeLa细胞增殖周期的影响，结果表明，SJAMP可以使HeLa细胞发生G1期细胞阻滞，而且随着SJAMP浓度的增加，其阻滞效果更加明显，各组细胞的凋亡率分别为0.25%、4.32%、11.36%和30.04%，差异有显著意义。说明SJAMP可以通过阻滞细胞周期，使DNA合成减少而发挥抗增殖作用。细胞周期过程中关卡受多种基因的控制。当这些基因出现异常扩增及突变导致异常表达，或表达下降、缺失都可导致基因组不稳或本应停止增殖的细胞不断越过关卡进入细胞增殖周期，引起细胞周期失控，导致细胞异常增殖。
PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，它在G1期的表达逐渐增加，S期达最高峰，而G2/M期则减少。PCNA的表达可能是DNA多倍体形式表达的一个标记，也成为肿瘤细胞失调状态下的一个标记，检测PCNA可以客观评价肿瘤细胞增殖状态[8]。本研究应用免疫细胞化学方法检测PCNA在HeLa细胞中的表达情况，结果表明，与对照组相比，各浓度SJAMP组PCNA的异常表达均显著降低(P<0.05)，并且有一定的剂量依赖关系。这一结果与TIAN等[9]的研究结果一致。由此可见，SJAMP可通过抑制HeLa细胞的异常表达，引起细胞周期发生G期阻滞，从而发挥抑制细胞增殖的作用。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5
Mdm2基因是一种癌基因，表达产物Mdm2蛋白能与P53结合，抑制P53对肿瘤活性的抑制作用，促使肿瘤的发生和发展及造成肿瘤对放疗、化疗的耐受，与不良预后有关[8]。本研究采用免疫细胞化学法检测HeLa细胞Mdm2蛋白的表达，结果显示，SJAMP作用与未作用的HeLa细胞均有Mdm2蛋白的表达，但与对照组相比，不同浓度SJAMP组Mdm2蛋白的表达均降低(P<0.05)，并且具有一定的剂量依赖趋势，提示SJAMP可下调Mdm2蛋白的表达，导致G1期阻滞，在细胞周期中发挥其抑制细胞增殖能力而产生抑癌作用。
综上所述，SJAMP可能通过降低细胞PCNA和Mdm2蛋白的异常表达，使细胞周期发生G1期阻滞，从而起到抑制细胞增殖的作用。
【参考文献】
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