埃本膦酸钠对肺癌细胞增殖及凋亡的影响

   【摘要】 目的 探讨第三代双膦酸盐埃本膦酸钠体外抑制肺癌细胞增殖、诱导凋亡的作用。方法 采用磺酰罗丹明B染色分析法、Annexin V-FITC/PI双染色荧光显微分析及流式细胞仪分析等技术检测不同浓度的埃本膦酸钠对肺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果不同浓度的埃本膦酸钠处理72h后，能明显抑制肺癌细胞的增殖（P<0.01），且这种作用与埃本膦酸钠的浓度有关;埃本膦酸钠导致小细胞肺癌H446的G 0 /G 1 期细胞增加，并表现为细胞凋亡峰（Sub-G1）随药物浓度升高而升高（P<0.01）。结论 埃本膦酸钠显著地抑制肺癌细胞在体外的增殖及诱导肺癌细胞的凋亡，其作用呈浓度依赖性。

　　关键词 埃本膦酸钠 肺癌细胞 细胞增殖 细胞凋亡

Effects of Ibandronate on inhibiting growth

and inducing apoptosis of lung cancer cells in vitro

Yu Huixin，Lin Xiufeng，Tan Cheng，et al.

State Key Laboratory of Nuclear Medicine，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi，Jiangsu214063.

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of Ibandronate on inhibiting growth and inducing apoptosis of lung cancer cell lines in vitro.Methods The cytotoxic effect of Ibandronate on lung cancer cells was determined us_ˉing SRB assay.DNA content assay was performed by PI staining through flow cytometry.Ibandronate induced apoptosis in lung cancer cells was identified by fluorescence microscopy with Annexin V FITC/PI staining.Results After incu_ˉbation of lung cancer cells with Ibandronate for72h，the inhibiting rates，with the increase of drug concentration，in_ˉcreased significantly（P<0.01）.Ibandronate induced H446cell apoptosis with both“G ₀ /G ₁ ”and“Sub-G ₁ ”phase peak increased in flow cytometry.Conclusion Ibandronate possess inhibitting activity and inducing apoptosis to lung cancer cells.These effects appear to be dose-dependent.

　　Key words Ibandronate lung cancer cells cell growth cell apoptosis

　　双膦酸盐（Bisphosphates，BPs）对钙和骨骼矿物质具有很强的亲和性，能紧密地吸附在羟基磷灰石的表面，是一类强有力的骨吸收抑制剂 ^［1，2］ 。因此在临床上被广泛应用于各种骨质疏松症的治疗 ^［3，4］ 。近年来发现双膦酸盐通过抑制破骨细胞的活性阻遏肿瘤细胞在骨上的着床和发展，对肿瘤的骨转移具有抑制作用 ^［5］ 。进一步的研究发现，双膦酸盐在体外对肿瘤细胞本身也具有抑制增殖的作用。目前已有双膦酸盐对乳腺癌及前列腺癌癌细胞抑制作用的报道 ^［6，7］ ，而对同样易于发生骨转移的肺癌研究较少，肺癌与乳腺癌及前列腺癌的骨转移率均可高达85% ^［8］ 。肺癌是常见肿瘤之一，随着工业化的发展，其发病率一直在上升，近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显增高，在男性癌症病人中，肺癌已居首位。我们通过第三代双膦酸盐—埃本膦酸钠对四株肺癌细胞体外增殖、诱导其凋亡作用的研究，以探讨埃本膦酸钠抑制肺癌骨转移的作用机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及材料 埃本膦酸钠（Ibandronate，BM210955）及亚甲基二膦酸钠（Medronate，MDP）均为本室自制 ^［9］ ;磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B，SRB）为Sigma产品;RPMI1640为GIBICOL产品;小牛血清由中国科学院上海实生细胞生物技术有限公司提供;其他试剂均为国产分析纯。肺癌细胞株（大细胞肺癌H460、小细胞肺癌H446、腺癌SPC-1及A549）均引自中国科学院上海细胞生物研究所;An_ˉnexin V-FITC凋亡检测药盒为BioVision产品。96孔细胞培养板为NUNC产品;荧光显微镜为日本Nikon公司的E_ˉclipse E600（具Y-FL EPI荧光附件）;流式细胞仪是美国BIO-RAD公司的BRYTE HS;酶标仪为BIO-RAD MODEL3550。

　　1.2 细胞培养 四株肺癌细胞均用含10%小牛血清的RP_ˉMI1640培液（含100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）于37℃，5%CO ₂ 培养箱中维持培养。

　　1.3 细胞增殖分析 参照Skehan的SRB方法 ^［10］ 。取生长良好的培养细胞，以1×104 个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，每组4个平行孔。空白组只加培养液。培养过夜待细胞贴壁后，实验组加入不同浓度药物（埃本膦酸钠或亚甲基二膦酸钠），并用培液补足300μl/孔。实验对照组不加药物。培养72h后，取出培养板，小心弃培液，慢慢加入200μl/孔经4℃预冷的10%三氯醋酸（TCA），室温静置5min，移至4℃放置1h。固定结束，弃去固定液，用蒸馏水洗涤3遍以去除TCA。经空气干燥后，加100μl/孔0.4%SRB染液，于37℃染色30min，弃染液，用1%醋酸洗涤3遍以充分去除未结合的SRB，空气干燥后，加150μl/孔10mmol/L Tris液溶解，微量振荡器振荡30s，酶标仪测量光吸收值A 531 。每个实验均重复3次。细胞增殖抑制率（%）=［1-（实验组A 531 -空白组A 531 ）/（对照组A 531 -空白组A 531 ）］×100%。

　　1.4 细胞凋亡分析 ^［7］ 取生长良好的肺癌细胞，以5×10 ⁴ 细胞/孔接种于已预先置有盖玻片的24孔细胞培养板中，培养过夜，制成细胞爬片。各孔中加入不同浓度埃本膦酸钠（20，100及200μmol/L），并用培液补足3.0ml/孔，继续培养72h，取出细胞爬片。按Annexin V-FITC/PI凋亡检测药盒说明进行处理，分别于荧光显微镜下观察、摄影（400×）及流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

　　1.5 细胞周期的测定 按2×10 ⁵ 个/孔将肺癌细胞接种于六孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，分别加不同浓度的埃本膦酸钠（20，100μmol/L）。继续培养72h后，消化、离心收集细胞，用-20℃的70%乙醇固定，经碘化丙啶染色后置流式细胞仪检测，分析细胞周期的变化。分析软件为ModFit LT。

　　1.6 数据统计分析 各项检测数据以ˉx±s表示，采用样本均数差别的t检验。

　　2 结果

　　2.1 埃本膦酸钠对肺癌细胞体外增殖的抑制作用 埃本膦酸钠及亚甲基二膦酸钠对四株肺癌细胞在体外增殖的抑制效果见图1（空白组的抑制率为0%）。两个不同的双膦酸盐对肺癌细胞增殖有不同程度的抑制作用，MDP的抑制效果很小，在低浓度时基本无影响（与对照组比较，除100μmol/L以上浓度对A549及400μmol/L对H446外，其余P均>0.05）;而BM210955的作用明显强于MDP（P均<0.01）。另外，不同的肺癌细胞对BM210955的敏感性也有差异，H446及SPC-A1相对较为耐受，而H460及A549则较 为敏感;在两组细胞间，不同浓度点P均<0.01。

　　2.2 埃本膦酸钠诱导肺癌细胞凋亡的分析 由于Annexin V能特异地与细胞膜上凋亡早期的标志物磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）结合，因此其与异硫氰酸荧光素（Flu_ˉorescein Isothiocyanate，FITC）联结后能使凋亡细胞的膜特异地染上绿色。在细胞凋亡晚期或死亡时，其膜的完整性开始受到破坏，此时，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）就可进入细胞与染色体结合，使核呈红色。小细胞肺癌H446正常组在培养过程中也发生少量的细胞凋亡现象，但以正常细胞为主，此类细胞Annexin V-FITC及PI均无染色（图2-A）。与不同浓度的埃本膦酸钠共同培养72h后，细胞发生明显的凋亡，20μmol/L的BM210955可使H446细胞出现明显的凋亡早期现象（图2-B）;随着药物浓度的升高，不同期凋亡现象也会同时出现（图2-C），凋亡早期细胞逐渐减少，而凋亡晚期细胞则相应增多，直至占主导地位（图2-D）。经流式细胞仪分析，20、100、200μmol/L埃本膦酸钠诱导的H446细胞凋亡率分别为3.3%、6.8%、9.3%，呈浓度依赖性。相关性分析显示药物浓度与凋亡发生呈正相关，即随着药物浓度增加细胞凋亡增加。

　　2.3 埃本膦酸钠对肺癌细胞周期的影响 正常生长状态下的H446细胞株大多数处于G ₀ /G ₁ 期，S期次之，G ₂ /M期最少。埃本膦酸钠能使细胞周期发生相对变化，随着药物浓度的增加，G ₀ /G ₁ 期细胞增多，而S期及G ₂ /M期细胞则相应减少（表1）。所有细胞样品均显示有DNA低含量颗粒（”亚G ₁ 期”峰，Sub-G ₁ 峰），即均有细胞凋亡发生。与对照组比较，20μmol/L时Sub-G ₁ 峰差异无显著性（P>0.05），而100μmol/L时凋亡发生差异有非常显著性（P<0.01）。

　　表1 埃本膦酸钠影响小细胞肺癌H446细胞周期的分析

　　注: ˇ P<0.01， △ P<0.05

　　3 讨论

　　双膦酸盐以P-C-P基团取代焦磷酸盐结构中的P-O-P基团，改变了焦磷酸盐的理化性质，增加了其对体内水解酶的稳定性，改善了其生物学性质 ^{［13，14］} 。结构中的碳原子含有2个取代基团R ₁ 和R ₂ ，R ₁ 以-H和-OH取代为主，主要参与双膦酸盐与骨矿化基质的结合过程;结构变化主要在R ₂ ，R ₂ 可能与双膦酸盐生物活性有关 ^{［11～13］} 。MDP是最简单的双膦酸盐，其R ₁