血友病甲基因诊断进展

　　血友病甲是最常见的遗传性出血性疾病，是由于血浆凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成。FVIII基因位于X染色体，所以患者绝大多数为男性，女性杂合子为携带者，而女性患者罕见。重型血友病自幼即反复自发出血，不经治疗造成关节畸形和致残。目前仍以替代治疗为主。随FVIII基因的克隆和基因突变检测技术的发展，血友病甲的基因诊断和遗传咨询工作也取得了突破性进展。在基因治疗技术相对不够成熟的情况下，基因诊断对于产前诊断和携带者诊出尤为重要，对于优生优育具有重要意义。

　　1 FVIII基因及突变

    FVIII基因定位于Xq28，1984年被克隆 ［1］  。基因全长186kb，包含26个外显子，转录成9010bp的cDNA，含150bp的5’非翻译区（UTR），57bp编码N端19个氨基酸的信号肽，6996bp的蛋白质编码区及1806bp的3’端UTR。编码区只占基因总长的5%，其余177kb为内含子序列，长度从207bp～34.2kb不等。在56和1241位密码子存在多态性。

    目前对FVIII基因的转录调控序列了解不多。 在FVIII基因内含子22中有两个基因F8A和F8B。这是哺乳动物首次发现的基因内基因。这两个基因间有一具有双向转录活性的CpG岛。F8A转录方向与FVIII相反，F8B与FVIII相同。X染色体远端距F8A约500kb处另有两个F8A同源基因。F8A可与两个同源基因之一发生同源重组，使FVIII基因从外显子1～22倒位至X染色体长臂远端，而外显子23～26仍处于原位。分裂的两部分不能被剪切到一起，导致重型血友病甲 ［2］  。

　　表1 不同引物对鉴别FVⅢ基因倒位的结果略

　　倒位可以用LD-PCR检测 ［3］  ，原理见图1、表1，与传统的Southern Blot相一致，但由于Southern Blot操作步骤多，流程长，出结果慢，难度大，且要放射性同位素，不利于开展。

　　图1 FⅧ基因远端倒位发生机制示意略

　　图2 突变与临床略

    FVIII倒位患者约占重型血友病甲的一半，而其他患者为多种突变，且不像地中海贫血那样有热点突变，多数散乱，且地域分布比较广，国外对白种人已有大规模检测FVIˉII突变数据库建立 ［4］  。国内也有相关单位作相关工作，但由于报道例数零散，不足以全面了解中国人的突变种类。现在发现的突变种类有:目前共知道突变431种，其中单碱基置换261种（61%），缺失突变147种（34%），插入突变23种（5%）。突变类型与临床情况相关，倒位和无义突变及缺失为重型，且缺失型易产生FVIII抑制物。错义突变导致轻中型血友病甲。

　　3 产前诊断的方法

    3.1 表型诊断和基因诊断

    3.1.1 表型诊断 可以抽取胎儿脐带血查FVIIIc活性。国外有少量报道在18～24周时的FVIII活性，但是（1）正常参考值不易建立，文献报道自出生后随胎肝成熟，FVIII因子有少量表达，随胎肝成熟而逐渐增加，但不能达正常成人水平。我们做过1例正常胎儿，其FVIII在5个月初为45%。（2）需要抽脐带血的条件，操作有相应的危险。我们实验室希望建立脐带血FVIII参考值，从4～5月龄胎儿取 （取脐血最早时期），以利于表型诊断，同时脐带血可以用于基因诊断。

    3.1.2 基因诊断 方法上分直接诊断和间接诊断。技术上经历了Southern Blot，PCR，生物芯片几个时期。Southern Blot比较麻烦，不适于临床检验，已不太使用，有PCR代替，而突变数据库的建立有利于生物芯片的研发。

    直接诊断:目前除倒位可用LD-PCR诊断外（如前述），其他突变由于散在，无热点突变，突变种类多（431种），检测手续繁锁。一般采用PCR-SSCP或PCR-DGGE ［5］  的方法检测突变，然后测序，这样可以检测未知突变并明确突变点，以利发现新的突变。间接诊断:为家系连锁分析，即通过FVIII紧密连锁的多态性标志来区别带病等位基因和非带病等位基因。现有多态性标志，一代多态性标志RFLP ［6］  ，二代多态性标志VNTR和STR，以及动态突变如（CA）n等 ［7］  。目前FVIII可用多态性位点 ［8～11］  ，见表2。

　　表2 目前可用的FVⅢ基因多肽性位点略

    间接诊断适用条件:（1）必须为有家系患者（即至少两个患者），因为假定只有一个患者，就不能确定是患者自身突变还是母亲生殖细胞突变引起的，要有先证者;（2）母亲必须是杂合子，才能区别不同等位基因。目前，可以连用多个多态性位点，可以做到完全诊断。

    3.1.3 基因诊断取样时间 ［12］   母亲血中胎儿有核红细胞:5～6周，绒毛活检:7～9周，羊水:16～20周，脐带血:18～24周。

    3.2 基因诊断展望 （1）基因芯片技术 ［13］  将是血友病诊断的又一利器，它可以集成成百上千的DNA片段，一次性检测。特别适合血友病这种突变种类多的遗传病检测。前期工作应建立血友病突变数据库，而中国人的芯片需要建立自身数据库;（2）作为第三代试管婴儿技术（IVF）的关键技术，植入前诊断（Preimplant Gene Diagnosis PGD） ［14］  。首先在卵裂球分裂为7～8个细胞时取1～2个细胞，体外用随机引物扩增全基因组，即PEP（Primer-extension Preamplificaˉtion） ［15］  技术，达到一定拷贝数，然后用前述基因诊断方法来确定哪个是正常的，哪个是异常的，以选择性植入。它要求的实验条件和技术水平都比较高。因为只能取1～2个细胞，且需迅速出报告，国外已有一些疾病PGD的报道 ［16］  。

　　参考文献

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　　作者单位:100044北京大学人民医院检验科 

    （收稿日期:2004-03-26） （编辑李 阳）