微量肝素对家兔缺血再灌流性肾损伤作用的实验研究

   【摘要】 目的 研究肝素对缺血再灌流肾损伤的作用。方法 将18只家兔随机均分为手术对照组，单纯缺血再灌流（IR）组和肝素处理（IR-肝素）组，分别观察1h再灌注96h血清中尿素氮（BUN）的含量，尿中尿蛋白含量，肾组织中乳酸脱氢酶（LDH）活力和一氧化氮（NO）含量以及光镜下组织结构改变。结果 光镜下，对照组结构正常，IR组可见缺血坏死改变，IR-肝素组损伤改变轻于IR组;IR组同对照组比较，BNU、尿蛋白和NO含量明显升高，LDH活力明显降低（P<0.05，以下同）;IR-肝素组同IR组比较，BNU、尿蛋白和NO含量明显降低，LDH活力明显升高，与对照组无明显差异（P>0.05）。结论 肝素对缺血再灌流肾损伤有一定的保护作用。

      关键词 肝素 肾 缺血 再灌流损伤

      Experimental study on effects of heparin on renal ischemic

      reperfusion injury in rabbits

      Zhang Chunlai，Zhao Chunling，Feng Zhiqiang，et al.

      Department of Physiology and Laboratory of Renal Function Protection， Luzhou Medical College，Luzhou646000.

      【Abstract】 Objective The purpose of the studywas to observe the effects of heparin on renal ischemic reperˉfusion（IR）injury in rabbits.Methods Eighteen rabbits were averagely and randomly divided into control group，IR group and heparin treatment group（IR-heparin group）in the study.At the time of reperfusio n 96hours after1hours renal ischemia，the blood urea nitrogen（BUN）in serum and the protein content in urine and the activity of lactic deˉhydrogenase（LDH）and the content of nitric oxide（NO）in renal tissue were detected;changes of histology in renal cortex was observed under light microscope.Results The serious degeneration and necrosis of renal tissue were obˉserved in IR group under light microscope，but there was only slight degeneration in IR-heparin group.Compared with control group，the contents of BUN in serum and protein in urine and NO in renal tissue in IR group were higher，but the activity of LDHwas lower.There was significant difference between them（P<0.05，under same）.In IR-heparin group，the contents of BUN in serum and protein in urine and NO in renal tissue were lower than those in IR group，the activity of LDH was higher than that in IR group;but there were no statistically significant difference between those in IR group and in IR-heparin group（P>0.05）.Conclusion The results indicated that heparin was effective in proˉtecting the kidney from IR injury.

      Key words heparin ischemia kidney reperfusion injury

      研究 ［1～3］ 表明，氧自由基在体内蓄积，细胞内Ca 2+ 超载，无复流现象，ATP耗竭与合成障碍，细胞粘附分子表达异常和中性粒细胞粘附、渗出、浸润等因素参与了IR肾损伤。肝素是多年来临床常用的抗凝药物，在体内可由血管内皮细胞、平滑肌细胞以及肾小球内皮、上皮细胞合成。近年来体内外的实验研究证明，肝素可通过间接抑制P-选择素，进一步抑制中性粒细胞的活化和聚集 ［4］ 。本文采用夹闭左肾动脉的IR损伤模型，研究微量肝素对家兔缺血再灌流肾损伤的作用，并初步探讨其机制。

      1 材料和方法

      1.1 材料 日本大耳白兔18只，雌雄不拘，体重（2.0±0.3）kg（由泸州医学院实验动物科标准动物室提供）。肝素钠注射液（上海生物化学制药厂生产，批号980923）。乳酸脱 ，肾功能保护研究室 氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、蛋白含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号991118）。

      1.2 方法 18只动物随机均分至手术对照组、单纯缺血再灌注（IR）组和肝素处理（IR-肝素）组。手术均在相对无菌的条件下进行，1%戊巴比妥钠2.5～3ml/kg，静脉注射，麻醉后，开腹去右肾并分离左肾动脉。IR-肝素组:耳缘静脉注射肝素0.2mg/kg，10min后，夹闭左肾动脉1h，去夹恢复左肾血液灌流，并关腹饲养;恢复再灌流2h时再注射一次等量肝素。IR组:将注射肝素改为注射等剂量生理盐水，余处理同肝素-IR组。手术对照组:模拟夹闭左肾动脉和恢复再灌流，余处理同IR组。各组再灌流96h时击昏动物，下腔静脉取血、取左肾和膀胱内取尿。

      1.3 检测指标 （1）测血清BUN含量，尿中的蛋白含量。（2）取肾下极皮质用10%福尔马林固定，作光镜检测。（3）在4℃条件下制成10%的组织匀浆，将匀浆用低温离心机以3000～4000r/min离心10～15min后，取适量上清液检测肾组织中的NO含量。（4）在4℃条件下制成1%的组织匀浆，测肾组织中LDH活力。

      1.4 统计学方法 数据均以均数±标准差（ˉx±s）表示，各组数据采用t检验，P<0.05表示组间差异有显著性。

      2 结果

      2.1 肾组织中NO含量和LDH活力 肾组织中LDH活力IR组低于对照组，IR-肝素组高于IR组，与对照组无显著差异;NO含量IR组高于对照组，IR-肝素组低于IR组，与对照组无显著差异（表1）。

      表1 各组肾组织中NO含量和LDH活力 （略）

      以100ml1%组织匀浆在37℃作用15min产生丙酮酸1个微克分子为1单位（U）。

      2.2 各组尿蛋白和血清BUN含量的变化 血BNU、尿蛋白含量IR组高于对照组，IR-肝素组低于IR组，与对照组无显著差异（表2）。

      表2 各组尿蛋白和血清BUN含量 （略）

      2.3 肾组织形态结构改变 光镜观察，对照组结构正常。IR组可见肾小管上皮细胞变性坏死，刷状缘脱落，管腔扩张，管腔内有脱落坏死细胞。IR-肝素组改变轻于IR组，可见部分肾小管刷状缘脱落，部分管腔扩张，内有少量脱落坏死细胞。

      3 讨论

      NO是一种潜在的舒血管物质，与肾IR损伤的发生密切相关，正常情况下，iNOs源性NO在局部具有舒血管及抑制血栓形成的作用，对实质器官细丙具有保护作用 ［5］ 。但在炎性细胞因子的作用下，巨噬细胞iNOs过量诱导所产生的大量NO则可引起细胞毒作用导致细胞损伤，进而加重肾损伤的发展 ［6，7］ 。本研究中，NO含量IR组高于对照组，IR-肝素组低于IR组，且与对照组无显著差异，提示微量肝素有利于减轻缺血后再灌注96h时IR肾组织中的NO含 量的升高，从而减轻由于大量NO引起的细胞毒作用而减轻肾组织损伤，本研究结果证实肝素处理组较IR组NO含量较低且肾组织结构损伤较轻，这与使用NOS抑制剂能减轻肾组织损伤的研究结果一致 ［1］ 。肝素是如何引起NO的产生减少还有待进一步研究。

      LDH广泛存在于各种组织细胞及体液，肾组织中LDH含量较心、肝、骨骼肌高。LDH常作为衡量细胞膜是否完整的重要指标，甚至被看作是IR所致细胞发生不可逆损害的指示剂 ［5］。本研究发现，肾组织中LDH活性IR组低于对照组，IR-肝素组高于IR组，与对照组差异无显著性，这与各组肾组织结构损伤程度不一致，这可能与本研究的取材时间和测定的肾组织中的LDH而不是漏出到血浆中的LDH有关。本研究取肾组织的时间为再灌注96h时，细胞结构损伤越重，LDH漏出进入血浆越多，随时间推移，由于酶合成速度低于酶漏出速度，肾组织中酶活力越低;另外，本室对离体猪肾IR的研究提示，LDH活力在IR肾损伤早期血浆中LDH变化明显，这与本研究的结果一致（论文待发表）。但其具体发生机制还有待进一步的研究阐明。本文观察到，肝素有减轻家兔肾IR所致的组织结构损伤和减少再灌注96h时血BUN和尿中蛋白含量的作用，提示肝素对缺血再灌流肾损伤有一定的保护作用。其机制除了本研究中观察到的与减轻肾组织中NO的含量升高而减轻其细胞毒作用有关以外，还可能与微量肝素的抗凝作用可减少微血栓形成，减轻微血管堵塞，减轻肾再灌流期间的灌注不全或无复流现象，以及肝素可通过间接抑制P-选择素，进一步抑制中性粒细胞的活化和聚集，减少中性粒细胞的激活、外渗与浸润，减轻内皮细胞的损伤有关 ［4］ 。

      参考文献

      1 Okusa MD.The inflammatory cascade in acute ischemic renal failure.Nephron，2002，90（2）:133-138.

      2 贺永进，高月平，李志华.肾缺血再灌流损伤的研究进展.河北医学，2003，9（8）:754-757.

      3 廖洪军.肾缺血再灌流损伤的介导因素.国外医学·泌尿系统分册，1992，22（3）:110-113.

      4 王锋，宋巍，周同，等.N-去硫酸肝素对肾缺血-再灌注损伤防治作用的研究.