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ischemic-reperfusion injury and apoptosis
Wang Fuyong，Sun Keqin，Li Suzhi，et al.
Department of Pathology，the General Hospital of Xizang Military District，Lasa850003.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of oxidative stress with apoptosis and bcl-2expression following ischemic-reperfusion（IR）injury.Methods On the model of rat liver subjected to ischemic-reperfusion injury，survey of oxidative stress on apoptosis and bcl-2expression IR in rats，L-arginine（2mg/kg）was adminis-tered intravenously before IR.Results At the1h reperfusion point，the levels of SOD and MDA，the apoptosis of hep-atocytes in L-arg group（92.4±10.5）mU/L，（27.80±4.7）mmol/L and30.12±3.6，respectively，significantly lower than those in the IR group（73.7±5.4）mU/L，（38.7±7.6）mmol/L，69.14±13.45，respectively，all P<0.05.The bcl-2expression of hepatocytes in L-arg group was83.8±18.6，significantly higher than in the IR group44.32±8.90（P<0.01）.Conclusion L-arg may block oxidative stress and halt the down-regulation of bcl-2expression.Also inhibit the apoptosis of hepatocytes and improve liver IR injury.
我们在大鼠肝缺血再灌注（Ischemic Reperfusion，IR）模型中，应用一氧化氮合酶的增强剂L-精氨酸，观察再灌注后过氧化物与肝细胞凋亡数的关系，探讨其肝细胞凋亡的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 SD大鼠40只，体重180～230g（西南民族学院实验中心提供）。随机将动物分成2组，Ⅰ:缺血再灌注（IR）组（n=20）;Ⅱ:L-精氨酸（L-arg）组（n=20）。每组按再灌注时间（1、3、6、24h）分为4个小组（n=5）。
1.2 动物模型制备 清洁大鼠，术前12h禁食。麻醉后，采用正中线入腹，用无创血管夹阻断肝左、中叶的肝血流，撤夹后恢复血流再灌注，所有动物均阻断60min。Ⅰ组:持续阻断60min，再灌注1、3、6、24h;Ⅱ组:先阻断50min时，于尾静脉注入L-arg2mg/kg（体重）10min，后操作同Ⅰ组。分别于再灌注后第1、3、6、24h点处死1个小组。取静脉血测丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）。
1.3 肝细胞凋亡、肝细胞Bcl-2的蛋白的检测 实验大鼠缺血-再灌注后1h时，迅速取出肝脏置于4%多聚甲醛中24h，随后进行常规石蜡包埋切片。切片经过常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后，应用dUTP缺口末端标记（TUNEL）法标记肝脏凋亡细胞。Bcl-2的蛋白检测采用S-P免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl-2蛋白表达。
1.4 凋亡细胞 含Bcl-2蛋白细胞的计数分析 正常肝细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核及含Bcl-2蛋白的胞浆为棕黄色。在光学显微镜下计数5个高倍视野（HPE，400×）中的阳性细胞核（胞浆）数及总细胞核数，并计算阳性细胞数占细胞核总数的百分比，求其均数值。
1.5 MDA、SOD检测 采用Lica400自动生化分析仪及配套试剂盒。（以上试剂均由南京建成生物工程研究所提供）。1.6 统计学方法 所有数据均以ˉx±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 大鼠肝缺血-再灌注后脂质过氧化物的变化 见表1。
2.2 缺血-再灌注后1h肝细胞凋亡水平的改变 见表2。结果显示:L-arg组TUNEL法阳性肝细胞核数量和阳性肝细胞核百分比均明显少于IR组（P<0.01）。
2.3 缺血-再灌注后1h肝细胞Bcl-2蛋白表达 见表3。结果显示:L-arg组Bcl-2蛋白表达阳性的肝细胞数以及Bcl-2蛋白阳性肝细胞数百分比均明显多于IR组（P<0.01）。
表1 缺血-再灌注后不同时点脂质过氧化物水平指标变化 （略）
表2 缺血-再灌注后1h肝细胞凋亡水平的改变 （略）
表3 缺血-再灌注后1h肝细胞Bcl-2蛋白表达 （略）
3 讨论
3.1 L-精氨酸对肝细胞的保护作用 L-arg是一氧化氮合酶的增强剂，笔者在实验中应用外源性L-arg，由缺血再灌注损伤模型的尾静脉注入L-arg，结果增加了IR后NO的合成（另发表），肝细胞凋亡要比实验对照组轻（见表2）。说明L-arg能增加NO的合成，抑制再灌注后肝细胞的凋亡。
3.2 氨自由基介导IR后细胞凋亡 氧自由基很容易与细胞内的大分子反应，或直接损伤它们，或启动一个链反应。
在该链反应中，自由基从一个大分子被传递到另一个大分子，从而导致细胞结构广泛损伤。氧自由基介导细胞凋亡的证据有 ［1］ :加入活性氧或耗竭细胞内抗氧化剂能导致细胞凋亡;细胞凋亡能被具有抗氧化能力的物质阻断。
缺血-再灌注后氧自由基大量增加，氧自由基可以介导膜结构的脂质过氧化反应。缺血再灌注损伤后细胞外钙离子内流，细胞内钙离子水平升高激活Ca 2+ 依赖的核酸内切酶，导致DNA降解发生凋亡。从本实验中发现，以L-arg对缺血再灌注处理后，脂质过氧化物MDA水平下降，凋亡细胞减少，说明减轻了细胞的过氧化反应所释放的氧自由基，降低了细胞凋亡，提示细胞凋亡与过氧化反应有关。有关肝细胞凋亡的机理有待进一步研究。
3.3 氧自由基诱导缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制 哺乳动物细胞线粒体和细胞质中反应性氧中间产物水平的调节，可能部分通过Bcl-2基因产物。Bcl-2基因是公认的凋亡抑制基因。Bcl-2蛋白可以减少自由基的产生，阻止脂质过氧化反应，增加还原性辅酶I和谷胱甘肽，使细胞对缺氧有更强的耐受性 ［2］ 。Bcl-2蛋白作为抗氧化因子可以阻止缺血再灌注后肝细胞凋亡。笔者对肝组织中Bcl-2的表达发现，凋亡数及百分比明显降低，L-arg组与IR组比较差异有显著性（P<0.05）。提示缺血再灌注损伤肝组织中Bcl-2的表达与细胞凋亡有关。我们认为，Bcl-2的表达是缺血再灌注损伤肝组织缺氧耐受的机制之一。
本研究结果提示，L-arg可减轻缺血再灌注后Bcl-2基因表达下凋，从而抑制创伤所致细胞凋亡，创伤性肝损伤导致肝细胞凋亡的中间环节之一是活性氧自由基的形成。通过使用广谱的协同的抗氧化物能预防过氧化反应诱导的细胞凋亡。
参考文献
1 Zhong LT，sarafian R，Kane DJ，et al.Bcl-2inhibits death of central neural cells induced by multiple agents.Proc Natl acad sci usa，1993，90:4533-4541.
2 骆纯，朱诚，卢亦，等.大鼠液压脑损伤后Bcl-2和Bax蛋白的表达改变.第二军医大学学报，2001，22:54-56.
作者单位:850003拉萨西藏军区总医院病理科
（收稿日期:2004-09-01）