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Polymer-surfactant treatment for acute lung injury induced by
lung-lavage in ventilated adult rats Gan Xiaozhuang，Song Guowei，Wang Fei，et al.
Capital Institute of Pediatrics，Beijing100020.
【Abstract】 Objective Previous studies have shown that addition of polymers such as dextran or polyethylene glycol（PEG）to pulmonary surfactants（PS）prevents and reverses surfactant inactivation in meconium or endotoxin in-duced acute lung injury（ALI）.The purpose of the study was to observe whether polymer-PS（Curosurf）mixtures are more effective than surfactant alone in lung-lavaged injury rats.Methods Adult Sprague Dawley rats，body weights（271±61）g（n=35），were anesthetized，catheterized and mechanically ventilated with an FiO 2 1.0.Repeated lung-lavage was performed with normal saline（NS）at30ml/kg and30min later，the animals became ALI and severe respi-ratory failure（PaO 2 <17.3kPa），and were randomly divided into four groups，receiving intratracheally:1）2.5ml/kg of NS（NS group）;2）PEG1.25ml/kg and PS1.25ml/kg（100mg/kg，PEG+PS group）;3）PS1.25ml/kg（100mg/kg）and NS1.25ml/kg，（PS+NS group）;and4）PS2.5ml/kg（200mg/kg，PS group）.The blood gas anal-ysis and static lung-thorax compliance were measured in the pre-or post treatment.At the end，protein leak in the right lung lavage fluid and histology in the left lung were performed.Results PaO 2 of the NS group remained<17.3kPa throughout the experiment，while that of the PEG+PS group and PS groups increased from10.1±2.4and（8.7±1.1）kPa to（62±16）kPa and（52±17）kPa，respectively，at30min of post-treatment，and maintained higher level during the ventilation.There were no significant differences in PaO 2 during180min between the two groups（57±9and48±19kPa at60min;54±15and47±16kPa at90min;54±17and43±16kPa at120min;51±12and40±15kPa at150min;44±16and35±15kPa at180min.P>0.05）.These value were higher than that of PS+NS group after60min（P<0.01or P<0.05）.The static lung-thorax compliance of the two groups（PEG+PS and PS groups）were improved in comparison with NS or PS+NS groups at90and180min of post-treatment，respectively（P<0.05）.The degree of intra-alveolar and interstitial hemorrhage and hyaline membranes were less prominent in the two groups（a four-grade scoring system:0，absent;1，mild;2，moderate;3，severe was used for estimating thedegree of the lungs'pathologies.Mean ranks:hemorrhage:11.0，14.0and24.4;hyaline:11.3，13.4and23.9）in comparison with NS group（P<0.01and P<0.05，respectively）.The protein content of the right lung lavage fluid in PEG+PS and PS group were lower than that of PS+NS groups（3.2±1.1，35±0.7and4.5±0.9mg/ml，re-spectively，P<0.05）.There is no significant difference in the lung index among different treatment groups.Conclu-sion The data suggest that PEG-PS improved lung function in this animal model and is more effective than surfac-tant alone in the same dose.Further preclinical studies are required.
急性肺损伤（ALI）是以急性呼吸窘迫，进行性低氧血症和肺水肿为特征的临床综合征，其严重阶段为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。在过去的20多年间，ARDS的死亡率在逐年下降，但仍很高，约为40%～68% ［1］ ，我国上海市小儿ARDS协作组报道为71.4% ［2］ ，它严重威胁危重病人的生命安全。肺表面活性物质（PS）可以降低肺表面张力，防止肺泡萎陷，改善肺的氧合。PS已成功地用于治疗新生儿呼吸窘迫综合征（RDS） ［3，4］ ，并正扩大应用于重症肺炎，胎粪吸入综合征等引起的ALI/ARDS ［5］ 。国外及我们以前的临床实验显示PS在LI/ARDS时能够改善肺氧合 ［6，7］ ，是一种有希望的新的治疗方法，但它对ARDS的治疗作用不如RDS，究其原因，RDS主要是肺泡Ⅱ型细胞分泌PS不足，而ALI/ARDS本质上是一种炎症和高肺血管通透性的综合征，大量的血浆蛋白渗出到肺泡腔，这些蛋白对内外源性PS均有明显的抑制作用，影响了PS对ARDS的治疗效果。因此国际上在这一领域研究的热点之一是如何制成新一代能明显对抗蛋白抑制的PS。 国外有人报道在体内外实验中将高分子聚合物（葡聚糖Dextran，或聚乙二醇PEG）等加入到PS中，明显降低了表面张力，逆转了蛋白对PS的抑制作用;明显改善实验动物的肺氧合和顺应性。本研究的目的是观察高分子聚合物和PS是否比单独应用同剂量的PS治疗大鼠肺灌洗诱导的急性肺损伤更有效。
1 材料与方法
1.1 实验动物 35只体重的健康SD大鼠（由维通利华实验动物技术有限公司提供），体重（271±61）g，雌雄不拘。实验前禁食12h。
1.2 实验用药 本实验所用的肺表面活性物质curosurf为意大利chiesi公司生产，是从猪肺匀浆中提取，含41%～48%卵磷脂，51%～58%其他磷脂和1%的疏水蛋白，药物浓度为80g/L磷脂。属于改良的天然PS制剂。
1.3 实验方法
1.3.1 肺灌洗造成大鼠急性肺损伤 大鼠经30～50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，行气管插管，将导管插入右颈内动脉。将大鼠接呼吸机进行机械通气。频率30次/min，吸呼比（I/E）1:2，吸入氧体积分数（FiO 2 ）:1.0，呼气末正压（PEEP）2cmH 2 O，潮气量（V T 为8～10ml/kg。用30ml/kg的生理盐水对大鼠进行肺灌洗造成急性肺损伤。
1.3.2 实验动物分组 当PaO 2 下降到17.3kPa继续通气30min后将动物随机分为四组:a）生理盐水（NS）组（n=8）:由气道给予NS2.5ml/kg;b）PEG+PS组（n=9）:给予PEG1.25ml/kg和PS1.25ml/kg（100mg/kg）;c）PS+NS组:给予PS1.25ml/kg（100mg/kg）和NS1.25ml/kg;d）PS组:给予PS2.5ml/kg（200mg/kg）。从大鼠的静动脉插管取血分别测定大鼠肺损伤前后和治疗后30、60、90、120、150、180min的血气分析和治疗后90、180min的静态胸肺总顺应性。
1.3.3 肺形态学检查 实验后处死大鼠，结扎其左支气管后切下左肺，称重并计算肺指数（左肺湿重/体重）。按常规方法固定，包埋，切片，HE染色后，在光镜下检查病理切片。用四级评分法来评价肺泡内和间质水肿，出血，肺透明膜形成，白细胞聚集和肺上皮坏死。（0无病理改变，1轻度改变，30%以下;2中度改变，30%～50%;3重度改变，50%以上）。
1.3.4 生化检查 用20ml/kg生理盐水灌洗右肺3次，用Lowry法测定灌洗液的总蛋白。
1.4 统计学方法 实验数据以均值±标准差（ˉx±s）表示，采用SPSS软件进行方差分析，t检验或非参数检验。P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
2.1 各组实验动物的一般情况 各组实验动物的体重、心率、动脉氧分压、二氧化碳分压等差异均无显著性。生理盐水组1只死于气胸。详见表1。
表1 不同治疗组实验动物情况 （略）
2.2 各组实验动物治疗后动脉氧分压的比较 在给予不同治疗的肺损伤大鼠中，NS组的PaO 2 在整个实验中一直低于17.3kPa，而PEG+PS组和PS组的PaO 2 在治疗后30min分别由（10.1±2.4）kPa和（8.7±1.1）kPa上升到（62.0±15.7）kPa和（51.9±17.3）kPa，并一直保持在较高水平（见图1:P<0.01，两组分别和NS组比较;P<0.05，两组分别和PS+NS组比较）。在180min的通气中两组PaO 2 差异无显著性。
图1 在180min通气中各治疗组PaO 2 改变
2.3 各组实验动物治疗后静态胸肺总顺应性的比较 见表2。两组的静态胸肺总顺应性分别在治疗后90和180min明显高于NS和PS+NS组（P<0.05或P<0.01），两组之间无显著改变。
2.4 各组实验动物治疗后肺形态学改变 PEG+PS组和PS组分别和NS组比较:肺泡内和间质水肿评分为11，14和24.4（P<0.01）;肺透明膜形成:11.3，11.4和23.9（P<0.05）。其他各项各组之间差异无显著性。各治疗组的肺指数差异无显著性。（PEG+PS组:0.29±0.063;PS+NS组:0.30±0.067;PS组:0.36±0.063，P>0.05）。
2.5 各治疗组动物实验后右肺灌洗液蛋白浓度比较 PEG+PS组和PS组的右肺灌洗液蛋白浓度明显低于PS+NS组（3.20±1.06，3.54±0.69和4.52±0.89mg/ml，P<0.05）。
表2 各组实验动物胸肺总顺应性比较 （略）注:和NS组比较， * P<0.05;和NS组比较， + P<0.01;和PS+NS组比较， # P<0.05
3 讨论
肺表面活性物质（PS）可以降低肺表面张力，防止肺泡萎陷，改善肺的氧合。但存在蛋白抑制物时，PS的活性会受到抑制，治疗效果受到影响。国内外学者在这方面进行了深入的研究，在体外实验中发现，纤维蛋白原，球蛋白，白蛋白对PS的抑制作用依次减弱。在临床实验中也发现PS治疗新生儿呼吸窘迫综合征能迅速改善肺氧合，而应用PS治疗新生儿胎粪吸入综合征时效果不如前者明显，这主要由于RDS主要是肺泡Ⅱ型细胞分泌PS不足，而ALI/ARDS本质上是一种炎症和高肺血管通透性的综合征，大量的血浆蛋白渗出到肺泡腔，这些蛋白对内外源性PS均有明显的抑制作用，影响了PS对ARDS的治疗效果。因此国际上在这一领域研究的热点之一是如何制成新一代能明显对抗蛋白抑制的PS。天然的肺表面活性物质组成中除了80%～90%的磷脂外，还有10%的蛋白质，含量最多的是亲水的肺表面活性物质蛋白A（SPA），还有疏水的SPB和SPC以及近年发现的SPD。SPA的一个重要功能是能抵抗渗出到肺泡的蛋白等物质对PS的抑制作用 ［8］ 。但现有的动物制剂不含SPA。国外学者报道在体外实验中将高分子聚合物（葡聚糖Dextran，或聚乙二醇PEG）等加入到PS中，明显降低了表面张力，逆转了蛋白对PS的抑制作用，并且它们降低表面张力的作用优于含有SPA的天然PS或加入一定量SPA的PS动物制剂 ［10，11］ 。高分子聚合物目前临床用于血浆代用品等，有较好的组织相容性。本实验结果表明，PS和PEG混合后治疗实验动物，改善了肺氧合和胸肺总顺应性，这和国外大多数学者报道是一致的。Lu报道给肺胎粪诱发的急性肺损伤大鼠高分子聚合物PEG-PS治疗，可明显改善肺氧合和顺应性（优于只用PS组）。推测高分子聚合物可使胎粪与PS解聚，使PS更易进入液-气界面发挥作用。他们还应用PEG -PS分别治疗用盐酸和内毒素诱导的急性肺损伤，发现大鼠的肺功能得到理好改善 ［12，13］ 。Kobayashi等人应用葡聚糖和PS混合物超声雾化的方式治疗由酸奶诱导的急性肺损伤大鼠，治疗效果（PaO 2 ，胸肺顺应性和病理结果）好于只用PS组 ［14］ 。Calkovska等人应用高分子聚合物（Polymyxin B）和PS混合物在动物实验中也取得了好的治疗效果 ［15］ 。但有学者报道在兔肺灌洗ALI模型中应用PEG-PS（Sur-vanta）治疗效果不如只用同剂量PS组 ［16］ 。我们在大鼠肺灌洗ALI模型中应用PEG-PS（Curosurf）治疗效果优于只用同剂量PS组。高浓度的PEG不利于肺水清除。本实验各治疗组的肺指数没有显著差别，说明我们所用的PS和PEG混合物没有加重肺水肿，所用PGE浓度合适。分析原因，可能和各实验所用的PS不同，PEG的浓度不同及配制方法不同等有关。我们认为所用浓度及配制方法是非常关键的。体外实验证实一定浓度的PEG和PS混合后明显降低了最大表面张力。因此进一步深入开展体内外实验研究，寻找最适浓度的PEG和PS混合物应用于ALI/ARDS的不同动物模型是非常必要的。
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作者单位:100020北京首都儿科研究所急诊科