骨桥蛋白和基质金属蛋白酶-9在肾癌组织中的表达及意义

    【摘要】 目的  探讨骨桥蛋白和金属基质蛋白酶-9（MMP-9）在肾癌组织中的表达及其临床意义。 方法  对43例肾细胞癌组织与6例正常肾组织标本，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨桥蛋白mRNA的表达，免疫组化检测MMP-9的表达。 结果  43例肾癌组织中骨桥蛋白和MMP-9表达阳性率分别为74.4%（32/43）和69.8%（30/43），骨桥蛋白mRNA表达与MMP-2和MMP-9表达呈正相关（P<0.01），两者表达在肿瘤的病理分级和临床分期之间差异具有显著性（P<0.05）。 结论  骨桥蛋白与MMP-9在肾癌组织中表达可能在肾癌的恶性进展中起协同作用，预示着肿瘤有较高的侵袭性。

   

    Expression and implication of osteopontin and matrix metalloproteinase-9 in renal cell carcinoma

    Chen Rusheng，Li Peihuan，Liu Bingqian，et al.

    Department of Surgery，8720Army Hospital of CAPF，Wuxi214035.
   
    【Abstract】 Objective To investigate the expression and clinical implication of osteopontin and matrix metal-loproteinase-9（MMP-9）in renal cell carcinoma（RCC）.Methods Expression of osteopontin and MMP-9was detected by RT-PCR and immunohistochemical methed in43cases of RCC respectively.Results The positive ex-pression rates of osteopontin and MMP-9were74.4%（32/43）and69.8%（30/43）in RCC respectively.The corre-lation between osteopontin and MMP-9expression was highly significant（P<0.01）.Both the gene expression were related to the tumor grade and clinical stage（P<0.05）.Conclusion The expression of osteopontin and MMP-9might play synergetic roles in the development of RCC and predicts more invasion.

   

    我们应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学技术检测肾癌组织中骨桥蛋白及金属基质蛋白酶-9（MMP-9）的表达，探讨其在肾癌组织中的表达及其相互作用，现报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 标本来源 43例肾癌组织标本取自本院及天津医科大学第二医院2002～2004年间经手术切除经病理证实的肾癌组织标本，Furhman分级:Ⅰ级10例、Ⅱ级18例、Ⅲ级15例，Robson分期:Ⅰ期16例、Ⅱ期19例、Ⅲ期6例、Ⅳ期2例。另切取相应的6例正常肾皮质作为对照。

    1.2 RT-PCR检测骨桥蛋白mRNA表达 TRIzol（Invitrogen公司）一步法从癌组织中提取总RNA，应用RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司）进行反转录合成单链cDNA。根据文献 ［1］ 合成引物（TaKaRa公司合成），上游:5′-AGAGTCGTTC-GAGTCAATGG-3′;下游:5′-CAGTTGCAGCCTTCTCAGCC-3′，产物330bp。内参照为β-actin，上游引物:5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′;下游引物:5′-GGATCTTC AT-GAGGTAGTCAGTC-3′，产物620bp。PCR反应条件94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，骨桥蛋白共30个循环，β-actin共25个循环。

    1.3 免疫组织化学检测MMP-9表达 MMP-9一抗及SP免疫组化试剂盒购自武汉博士德医学生物工程公司，按说明书进行常规免疫组化检测，PBS代替一抗作为阴性对照，一例已证实MMP-9染色阳性的胃癌标本作为阳性对照。

    1.4 结果判定 细胞胞质呈棕黄或褐色为阳性细胞。参考文献 ［2］ 计算评分:（1）染色强度:0为阴性，1为弱阳性，2为中等阳性，3为强阳性;（2）阳性细胞数:0为无阳性细胞，1为阳性细胞数1%～25%，2为阳性细胞数25%～50%，3为阳性细胞数超过50%。（1）+（2）之和为3～6分的评为免疫组化染色阳性。

    1.5 统计学处理 应用SPSS10.0软件进行χ 2 检验。

    2 结果

    2.1 RT-PCR及免疫组化检测结果 结果显示正常组织中未检出骨桥蛋白mRNA及MMP-9表达，43例肾癌组织中发现32例骨桥蛋白mRNA表达阳性和30例MMP-9表达阳性，阳性表达率分别为74.4%和69.8%（图1，表1）。2.2 骨桥蛋白与MMP-9表达的关系 骨桥蛋白与MMP-9均表达阳性的为19例（44.2%），骨桥蛋白阳性、MMP-9阴性的5例（11.6%），骨桥蛋白阴性、MMP-9阳性的6例（14.0%），二者均阴性的13例（30.2%），骨桥蛋白与MMP-9表达呈正相关（P<0.05）。:DL2000marker;0:正常肾组织;1:Ⅰ期肾癌;2:Ⅱ期肾癌;3:Ⅲ期肾癌;4:Ⅳ期肾癌

    图1 骨桥蛋白RT-PCR产物电泳结果

    表1 骨桥蛋白与MMP-9表达与肾癌分级及分期的关系（略）

    3 讨论

    人骨桥蛋白的编码基因位于染色体4q13位点上，骨桥蛋白是一种分泌型的磷酸化的糖蛋白，分子量约66kDa，其所含的RGD（精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸）序列是与细胞粘附有关的重要功能域，通过其受体整合素α v β 1 、α v β 3 、α v β 5 、α 9 β 1 和CD44等，骨桥蛋白可促进细胞的趋化、粘附和迁移，在肿瘤的发生发展，特别是转移的过程中发挥重要作用 ［3，4］ 。本实验结果表明骨桥蛋白mRNA在肾癌组织中有高水平表达，且与肿瘤分级和分期呈正相关，而在正常肾皮质组织中未见阳性表达，此结果与Agrawal D报告的结果一致，说明骨桥蛋白极有可能在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。恶性肿瘤的远处转移过程中，细胞外基质的降解和再塑形起着非常重要的作用。Ⅵ型胶原是基底膜的主要成分，其降解酶为MMP-2、9等 ［2］ 。Rangaswami H等 ［5］ 报告骨桥蛋白可以通过IkBa/IKK信号途径激活MMP-9表达，加快肿瘤细胞周围的Ⅵ型胶原等细胞外基质的降解，为肿瘤细胞的组织浸润及转移提供有利条件。我们研究表明，MMP-9在肾癌组织中有高水平表达，且与肿瘤分级和分期呈正相关，而在正常肾皮质组织中未见阳性表达，并且与骨桥蛋白表达密切相关。文献报道整合蛋白可以促进MMP-9表达，其通过RGD位点与已经被基质蛋白酶水解的胶原相结合，使肿瘤细胞α v β 3 受体表达增强，从而提高肿瘤细胞的浸润和转移能力 ［2］ 。骨桥蛋白可能通过与整合素α v β 3 受体的相互作用激活与肿瘤转移、浸润有关的基因表达，促进肿瘤的转移。但是对于骨桥蛋白参与的信号通路:从激活的受体转导信号，到最终的细胞内基因表达的改变，及其中参与的调节因子等诸多细节还不十分清楚，仍需进一步研究

    参考文献

    1 贺斌，刘银坤，汤钊猷，等.肝癌中骨桥蛋白表达的临床意义.中华肝脏病杂志，1998，6:208-210.

    2 孙现军，姜希宏，候文红，等.骨桥蛋白与MMP-9在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关系.肿瘤防治杂志，2003，4:370-372.

    3 丁凌，郑树，曹江，等.大肠癌及其肝转移组织骨桥蛋白mRNA的表达.中华医学杂志，2002，82:970-973.

    4 Agrawal D，Chen T，Irby R，et al.Osteopontin identified as lead marker of colon cancer progression，using pooled sample expression pro-filing.J Natl Cancer Inst，2002，94:513-521.

    5 Rangaswami H，Bulbule A，Kundu GC.Nuclear factor inducing kinase plays crucial role in osteopontin induced MAPK/IKK dependent nuclear factor kB-mediated promatrix metalloproteinase-9activation.J Biol Chem，2004（in press）.

   

    作者单位:214035江苏无锡武警8720部队医院外科
    100730北京中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所病理科
    300211天津市泌尿外科研究所