霍夫包尔细胞和凋亡相关蛋白在重度子痫前期胎盘的表达

    【摘要】 目的  研究霍夫包尔细胞（Hofbauer cell，HC）和凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax在重度子痫前期患者晚孕胎盘的表达及意义。 方法 采用免疫组化技术和图像分析系统分别对30例正常（对照组）和30例重度子痫前期（观察组）晚孕胎盘中的霍夫包尔细胞、Bcl-2和Bax的表达进行分析。 结果  观察组霍夫包尔细胞数量（22.03±3.23）大于对照组（8.13±2.83），差异有非常显著性（P<0.01）。Bcl-2分布于合体滋养细胞，观察组Bcl-2平均密度（optical density，OD）（53.71±3.54）小于对照组（65.41±3.59），差异有非常显著性（P<0.01）。Bax主要分布于合体滋养细胞，观察组Bax平均密度（41.82±3.54）大于对照组（34.65±2.53），差异有非常显著性（P<0.01）。观察组Bax/Bcl-2（0.78±0.02）大于对照组（0.53±0.01），差异有非常显著性（P<0.01）。相关性分析提示两组中霍夫包尔细胞同合体滋养细胞凋亡水平呈高度正相关（相关系数分别为0.864和0.854）。 结论  重度子痫前期晚孕胎盘凋亡相关蛋白诱导的合体滋养细胞凋亡增加，可能与过多的霍夫包尔细胞有关。
       
     
　　Expression of Hofbauer cells and apoptosis related proteins in third trimester placentas of severe pre-eclampsia
     
　　Liu Zhi，Zhang Xi，Cui Shihong，et al.
   
　　Department of Obstetrics and Gynecology，Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
   
　　【Abstract】 Objective To discuss the expression of Hofbauer cells（HCs）and apoptosis related proteins（Bcl-2，Bax）in third trimester placentas of severe pre-eclampsia（PE）.Methods Immunohistochemical technique and image analysis system were applied to detect and analyze the expression of HCs，Bcl-2and Bax in placentas from PE（n=30）and normotensives（NT，n=30）.Results The number of HCs was more abundant in PE（22.03±3.23）than in NT（8.13±2.83）（P<0.01）.The average optical density（OD）of Bcl-2which was present in the syncy-tiotrophoblasts（STs）was smaller in PE（53.71±3.54）than in NT（65.41±3.59）（P<0.01）.The OD of Bax which was primarily found in STs was more prominent in PE（41.82±3.54）than in NT（34.65±2.53）（P<0.01）.The ratios of Bax/Bcl-2were significantly different between PE（0.78±0.02）and NT（0.53±0.01）（P<0.01）.And there were highly positive relations between the number of HCs and the level of apoptosis in STs.Conclu-sion In severe pre-eclampsia，there may be a relation between excessive Hofbauer cells and increasing apoptosis induced by apoptosis related proteins，namely Bcl-2and Bax.
      
      
　　霍夫包尔细胞是一种来源于胎盘绒毛间质的巨噬细胞，由于该类细胞紧邻着绒毛滋养细胞和胎儿血管内皮细胞，并具有合成和分泌多种细胞因子的生物活性，我们推测霍夫包尔细胞可能在妊娠过程中参与对胎盘局部微环境的调节。本实验采用免疫组化技术和计算机图像分析系统对霍夫包尔细胞和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax在正常及重度子痫前期患者晚孕胎盘的表达进行了分析，试图探讨霍夫包尔细胞和凋亡相关蛋白在重度子痫前期病理机制中的作用及两者之间的联系。

　　1 资料与方法
    
　　1.1 一般资料 选取2003年1月～2004年1月在郑州大学第三附属医院妇产科住院分娩的重度子痫前期患者30例为观察组（PE），平均年龄（29.3±3.5）岁，平均孕周（38.5±1.7）周。重度子痫前期诊断标准参照乐杰主编《妇产科学》（第六版） ［1］ 。另选同期入院分娩的正常妊娠妇女30例作为对照组（NT），无任何合并症和并发症，平均年龄（28.0±3.2）岁，平均孕周（38.9±1.4）周。比较两组孕妇的年龄、孕周，差异均无统计学意义（P>0.05），两组病例均无吸烟及孕期大量药物服用史，亦无孕期感染及孕晚期发热史。
   
　　1.2 方法
   
　　1.2.1 标本采集 自然分娩或选择性剖宫产胎盘娩出5min内，在胎盘母面中央（避开钙化、坏死部位）取材1块，约1cm×1cm×1cm大小，立即用福尔马林固定，24h后石蜡包埋固定，4μm连续切片，60℃烤箱过夜烤干后置37℃温箱保存备用。
   
　　1.2.2 仪器和试剂 图像分析仪采用上海山富科学仪器有限公司Powersite显微图像采集分析系统（型号:Powersite410）。鼠抗人CD68mAb（MΦ标记物）工作液、鼠抗人Bcl-2mAb工作液、鼠抗人BaxmAb工作液、DAB试剂盒以及PV-9000二步法试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2.3 实验方法 采用PV-9000二步法检测CD68、Bcl-2和Bax。脱蜡、水化组织切片后，3%H 2 O 2 室温下孵育10min，热修复30min，一抗4℃过夜，PV-9000试剂1室温下孵育20min，PV-9000试剂2室温下孵育30min，DAB显色后，苏木素复染、中性树胶封片。阳性对照采用已知阳性切片，阴性对照采用PBS替代一抗。
   
　　2.4 结果判定和图像分析 CD68、Bcl-2和Bax阳性细胞为胞浆中有棕黄色颗粒者。每例随机选取10个高倍视野（40×10倍），用免疫组化图像分析系统分别计算每高倍视野的霍夫包尔细胞个数以及Bcl-2和Bax的平均密度，进而求出每例胎盘标本的霍夫包尔细胞平均个数及Bcl-2、Bax的平均密度（OD）。以Bax/Bcl-2表示胎盘促（抑）凋亡间的平衡 ［2，3］ 。
   
　　1.3 统计学方法 所有数据均采用SPSS12.0进行处理，结果用表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，相关分析采用Pearson相关分析，以P<0.05作为显著性标准。
    
　　2 结果
    
　　（1）在两组胎盘中，霍夫包尔细胞（CD68+）定位于绒毛间质;Bcl-2表达于合体滋养细胞;Bax主要表达于合体滋养细胞，少量表达于细胞滋养细胞。具体情况如表1。

　　表1 霍夫包尔细胞、Bcl-2和Bax在两组胎盘的表达情况 （略）
    
　　注: * t=17.735，P<0.01; ** t=-12.714，P<0.01; *** t=9.033，P<0.01; **** t=52.007，P<0.01
      
　　（2）取两组的霍夫包尔细胞个数、Bcl-2和Bax的平均密度分别同相应的Bax/Bcl-2进行相关分析，结果如表2。
    
　　表2 两组中各指标同Bax/Bcl-2相关性分析（略）

　　3 讨论
    
　　3.1 霍夫包尔细胞在正常及重度子痫前期患者晚孕胎盘上的表达差异及意义 文献报道，霍夫包尔细胞在胎盘绒毛间质中依靠有丝分裂实现自我更新，其数量可能和外环境有关，并随妊娠月份增加而减少 ［4］ 。本研究证实在重度子痫前期患者晚孕胎盘绒毛间质中存在大量的霍夫包尔细胞，与正常晚孕相比存在非常显著性差异。我们推测可能是由于胎盘局部微环境的改变使霍夫包尔细胞活化，产生有丝分裂，数量增多，吞噬功能及分泌免疫活性细胞因子的能力也增强。我们推测此时活化的霍夫包尔细胞可能发挥对机体有利和（或）有害两种相反作用。对机体有利的是:活化的霍夫包尔细胞可以将导致胎盘微环境改变的异常物质吞噬降解，抑制免疫应答，纠正胎盘局部免疫失衡;对机体有害的是，活化的霍夫包尔细胞分泌过量的活性细胞因子，可能会进一步加剧胎盘局部的免疫失衡，导致病理妊娠的发生和发展。我们推测胎盘局部微环境的改变方式和程度可能决定了霍夫包尔细胞的功能。研究显示，重度子痫前期晚孕胎盘GM-CSF和M-CSF水平上升 ［5］ 。左建新等 ［6］ 认为妊高征患者胎盘M-CSF水平的明显增加是促使胎盘中的巨噬细胞大量增殖、激活的主要原因。引起重度子痫前期患者晚孕胎盘霍夫包尔细胞异常增多的原因以及它们的功能鉴定还需要进一步的实验研究。
   
　　3.2 凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax在正常及重度子痫前期患者晚孕胎盘上的表达差异及意义 本研究显示在正常和重度子痫前期患者晚孕胎盘Bcl-2和Bax主要表达于合体滋养细胞，正常组Bcl-2高于重度子痫前期组，正常组Bax低于重度子痫前期组，正常组Bax/Bcl-2低于重度子痫前期组，均有非常显著性差异（P<0.01），提示重度子痫前期组胎盘合体滋养细胞凋亡较正常组为高。相关性分析显示Bax跟凋亡的关系更紧密。然而，也有报道并不支持Bcl-2和Bax与重度子痫前期合体滋养细胞凋亡有关 ［7］ 。因此，关于Bcl-2和Bax在重度子痫前期患者晚孕胎盘中表达的研究还存在争议，然而对妊娠期高血压疾病与胎盘滋养细胞凋亡增加有关已经达到共识。Nelson ［8］ 认为正常晚孕胎盘合体滋养细胞凋亡的增加可能与母胎界面氧气和营养物质交换增加有关。对于重度子痫前期患者晚孕胎盘合体滋养细胞凋亡的异常增多，推测其机制有两种:（1）合体滋养细胞的大量凋亡可能是重度子痫前期晚孕时，母体在胎盘血流灌注减少、胎盘缺氧而胎儿对氧气和营养物质需求量增加的情况下采取的一种代偿机制，有利于氧气和营养物质在母胎界面上的交换。如果代偿不完全的话，可能导致胎儿宫内生长迟缓的发生。（2）合体滋养细胞的大量凋亡造成胎盘屏障功能的破坏以及胎盘局部分泌功能和免疫调节机制的紊乱，可能会进一步加重胎盘局部微环境的改变，影响重度子痫前期的病程。上述两种机制可能不同程度地影响重度子痫前期的病理发展过程。
   
　　3.3 霍夫包尔细胞与胎盘滋养细胞凋亡的关系 相关性分析提示霍夫包尔细胞与两组胎盘合体滋养细胞凋亡高度相关。我们推测其作用机制至少包括两个方面:（1）TNF-α与IFN-γ的作用:Zhe Liu等 ［9］ 在动物实验中证实，IFN-γ可诱导新西兰兔胎盘凋亡增加并改变Bax/Bcl-2的比值。研究表明，TNF-α与IFN-γ可协同作用诱导体外培养的滋养细胞凋亡 ［10］ 。重度子痫前期时，霍夫包尔细胞活化可大量分泌TNF-α和IFN-γ，可能使胎盘滋养细胞凋亡增加。（2）PGE 2 和TXA 2 的作用B.Wetzka ［11］ 证实体外缺氧环境下培养的霍夫包尔细胞提取液中，PGE 2 水平下调而TXA 2 水平维持不变。而缺氧条件下，体外培养滋养细胞的凋亡增加伴随p53和Bax上调以及Bcl-2的下调 ［12］ 。因此，推测在重度子痫前期时，PGE 2 下调和胎盘缺氧会形成恶性循环，由此引发Bcl-2家族诱导的滋养细胞凋亡。
   
　　研究证实，霍夫包尔细胞通过分泌多种细胞因子来调节滋养细胞的生长和分化。本研究从霍夫包尔细胞与凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的关系对合体滋养细胞凋亡的情况进行了研究。相信随着对霍夫包尔细胞研究的不断深入，人们会更进一步地了解妊娠过程中的调控机制。
    
　　参考文献
    
　　1 乐杰.妇产科学.第六版.北京:人民卫生出版社，2004，97-104.

　　2 李翠兰，胡章和，曹来英，等.重度妊娠高血压综合征患者胎盘组织中细胞凋亡及其调控基因的研究.中华妇产科杂志，2000，35:335-337.
   
　　3 M.De Falco，L.De Luca，F.Acanfora.Alteration of the Bcl-2:Bax ra-tio in the placenta as pregnancy proceeds.The Histochemical Journal，2001，33:421-425.
   
　　4 魏俊综述，王自能审校.胎盘Hofbauer cell结构和功能的研究现状.现代妇产科进展，2001，10:373-375.
   
　　5 Masatoshi Hayashi，MD，PhD，Yoshinobu Hamada，MD，Takeyoshi Ohku-ra，MD，PhD.Elevation of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the placenta and blood in preeclampsia.American Journal of Obstetrics and Gynecology，2004，190:456-461.
    
　　6 左建新，张陵娜，曾文洁.胎盘组织中诱导型一氧化氮合酶和巨噬细胞的表达与妊娠高血压综合征发病的关系.中华妇产科杂志，2002，37:331-334.
   
　　7 Alexander D.Allaire，MD，MSPH，Kelly A.Ballenger.MD.Stevern R.Wells，MD.Placental Apoptosis in Preeclampsia.Obstet Gynecol，2000，96:271-276.
   
　　8 D.M.Nelson.Apoptotic Changes Occur in Syncytiotrophoblast of Human Placental Villi where Fibrin Type Fibrinoid is Deposited at Discontinu-ities in the villous trophoblast.Placenta，1996，17:387-391.
   
　　9 Zhe Liu，Quan-Hong Sun，Ying Yang.Effect of IFNg on caspase-3，Bcl-2and Bax expression，and apoptosis in rabbit placenta.Cytokine，2003，24:201-209.
   
　　10 I.P.Crocker，S.Barratt，M.Kaur.The In-Vitro Characterization of Induced Apoptosis in Placental Cytotrophoblasts and Syncytiotro-phoblasts.Placenta，2001，22:822-830.
   
　　11B.Wetzka，D.E.Clark，D.S.Charnock-Jones.Isolation of macrophages（Hofbauer cells）from human term placenta and their prostaglandin E2and thromboxane production.Human Reproduction，1997，12（4）:847-852.
   
　　12 Roni Levy，Steven D.Smith，Kala Chandler.Apoptosis in human cul-tured trophoblasts is enhanced by hypoxia and diminished by epidermal growth factor.Am J Physiol Cell Physiol，2000，278:C982-C988.

　　作者单位:450052河南郑州大学第三附属医院妇产科