【摘要】 RNAi，作为一种调控特定基因表达的手段，被称为基因组的免疫现象，已成为最近生物医学领域的研究焦点之一。本文就RNAi技术在抑制
肿瘤和HIV、HBV、HCV、SARS等病毒以及其它一些疾病的研究进展。
关键词 RNAi 肿瘤 HIV HBV HCV SARS
Advance of applied research in medicine through RNAi technology
Miao Lingfeng，Yang Fan，Zhang Shuzhen
1State Key Laboratory of Tropical Crops Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou571101.
2Institution of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou571101.
【Abstract】 RNAi，as the immune phenomenon of the genome，has emerged as an approach to modulate spe-cific gene expression and become the focus in the field of biomedicine.This review summaries the research develop-ment of RNAi in inhibiting tumor，HIV，HBV，HCV，SARS and other virus.
Key words RNAi tumor HIV HBV HCV SARS
RNAi（RNAi interference，RNA干涉）是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA（有义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的 ［1］ 。人工合成的si RNA（small interfering RNA，小分子的干涉RNA）是长度为21～25个核苷酸大小的小RNA分子，它可以与RISC共同发挥作用，使沉默复合物识别靶目标。目前研究表明，在许多生物体中导入dsRNA，可引起体内同源基因特异性沉默，当病毒RNA侵入细胞后，RNAi就是机体监视系统的成员，检测病毒信息，降解病毒核酸和蛋白、维持宿主基因组的稳定性，保护机体不受病毒侵犯 ［2］ 。自从1998年Fire等 ［3］ 提出siRNA以来，短短的几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的深入研究，为成功地应用RNAi研究与治疗
遗传性疾病、病毒感染、免疫缺陷疾病和肿瘤等重大疾病提供了理论基础，而且目前已取得重大进展，尤其是在肿瘤、
艾滋病和肝炎等方面。
1 RNAi的应用研究进展 1.1 RNAi在肿瘤抑制中的研究进展 肿瘤是多基因、多因素疾病，是多个基因相互作用的基因网络调控的结果。传统技术诱导的单个癌基因的阻断往往不可能完全抑制或逆转肿瘤细胞的生长，因此也很难达到预期的治疗效果，而RNAi技术则不同，利用siRNA干涉技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或休眠状态，而且抑制效果互不干扰，从而有望达到抗肿瘤作用。
在白血病和淋巴瘤的研究中，Wilda等 ［4］ 应用RNAi成功地阻止了慢性髓性白血病和急性淋巴母细胞瘤瘤细胞的生长分化。Cioca等 ［5］ 分别转染针对c Raf和Bcl2的siRNA进入多株人白血病细胞后，两者的蛋白质水平显著降低，沉默cRaf表达后抑制了TPA诱导HL60细胞发生单核细胞样分化。Brummelkamp等 ［6］ 利用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中，特异性地抑制了癌基因Kras（V12）的表达，在急性髓性白血病的研究方面也取得了比较乐观的结果。Means等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7
乳腺癌细胞中异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因spl的功能。Elbashir等 ［7］ 用人类宫颈癌Hela细胞作为研究对象，将体外合成相应的特异性siRNA转染入癌细胞中，检测其前后的变化，结果发现其靶向mRNA所表达的蛋白质的量比转染前降低了90%。Lin等 ［8］ 利用RNAi技术使Bcl2基因静寂，从而抑制了前列腺癌LNCaP细胞的生长，并可见到染色体浓缩、基因组DNA断裂等细胞凋亡的特征性变化。Schijver等 ［9］ 使用高度特异的RNAi技术，沉默前列腺腺癌LNCaP细胞中FASE的表达，FASE的沉默抑制了LNCaP细胞的生长和最终导致其凋亡，而不会影响非恶性的上皮成纤维细胞的生成能力。
宫颈癌的发生与HPV16的癌基因E6和E7的表达息息相关，Jiang等 ［10］ 用化学合成的siRNA在HPV阳性的宫颈癌CaSki细胞和SiHa细胞中干扰这两个基因，结果显示E6和E7的mRNA及蛋白质均选择性下降，E6被沉默后导致p53蛋白的增加，激活细胞周期调控基因p21细胞生长受抑制，而沉默E7后细胞集聚并且凋亡。肿瘤细胞的锚定粘附过程受中介素α6β4的调节，Lipscomb等 ［11］ 采用化学合成的siRNA在MDA MB231细胞内，分别沉默中介素α6β4的亚基α6和β4基因，结果显示两个基因的表达抑制并能引起细胞表面中介素α6β4水平的降低，使细胞的恶性侵袭性与非依赖于配体的转移性均明显减弱。fral基因在恶性间皮瘤细胞高表达，RamosNino等［12］ 通过RNAi技术沉默被石棉刺激后的正常胸膜上皮细胞fral基因，结果显示fral的mRNA与蛋白质水平均下降。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因，形成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR1基因编码的pgp糖蛋白过度表达，为寻找克服MDR的新方法，Wu等使用化学合成的siRNA在乳腺癌具有MDR表型的MCF7/Adr和MCF7/BC19细胞干扰MDR1的表达后，MDR1的mRNA和pgg水平显著下降。
1.2 RNAi在HIV中的研究进展 HIV感染是一个世界性难题，给人们生命带来巨大威胁，但目前还缺乏有效的疫苗和治疗方法。RNAi的问世，为HIV感染者带来生的希望。在感染细胞中，HIV的复制被针对结构基因gag和env的dsRNA以序列特异性的方式完全抑制。Capodici等 ［13］ 以HIV的Gag和3′-末端重复序列为靶基因进行RNAi的研究，结果显示病毒在逆转录之前就已经被抑制了。HIV-1衣壳Gag多聚蛋白水解为P24、P17和P15多肽，其中P24多肽与病毒脱壳、组装有关。在侵染HIV两天之前先将P24-siRNA转染到表达人CD4的Hela细胞（Hela-CD4）中，侵染HIV两天后P24-siRNA转染细胞与对照相比病毒减少了4倍多。另外，Jacque等 ［14］ 设计了针对HIV-1基因数个区域的siRNAs，这些区域包括长末端重复序列（LTR）及辅助基因vif和nef。siRNAs和HIV-1前病毒DNA共转染Magi细胞24h后病毒复制减少95%以上;当siRNAs转染至外周淋巴细胞时，siRNAs诱导特异序列降解、阻止病毒中间体形成、防御HIV感染细胞。
CD4是公认HIV的受体，HIV的包膜糖蛋白gp120与CD4分子结合是感染的第一步。Novina等 ［15］ 发现RNAi有对抗CD4和其他细胞表面受体的作用，而HIV病毒正是通过这些受体进入宿主细胞，说明RNAi可以通过使CD4的表达沉默来阻断感染。HIV传播需要两种主要的辅助受体，即趋化因子受体CCR5（巨噬细胞嗜性HIV辅助受体）和CXR4（T细胞嗜性HIV辅助受体）。针对CXCR4和CCR5的siRNA能够有效的阻碍它们在细胞表面的表达，继而阻止它们随后作为HIV辅助受体的功能。美国加州理工学院Baltimore实验室 ［16］ 的研究人员用小干扰RNA（siRNA）转染外周血T细胞，使CCR5表达量减少约10倍，从而使感染细胞数减少6倍以上。Novina等以Hela衍生细胞系Magi-CCR5为对象探讨siRNA抑制HIV-RNA侵染的可能性。实验中转染CD4-siRNA3天后CD4-mRNA大约降低8倍。Martinez等 ［13］ 研究表明，以CXCR4-siRNA转染CXCR4 + -U87-CD4 + 细胞，48h后细胞CXCR4表达减少到63%，而CCR5-siRNA转染CCR5 + -U87-CD4 + 细胞可使CCR5表达降低到48%。CXCR4、CCR5的表达降低有效地抑制CX-CR4 + 的U87-CD4 + 细胞被X4（NL43）HIV感染、有效地抑制CCR5 + 的U87-CD4 + 细胞被R5（Bal）HIV感染。
1.3 RNAi在HBV中的研究进展 全世界大约有三亿五千万慢性
乙肝病毒（HBV）感染者，每年由于急慢性感染HBV而死亡的人数达到100万 ［17］ ，因此，抗乙
肝病毒治疗至关重要。目前，药物抗病毒治疗还没有取得根本的突破。而RNAi技术的出现为抗乙肝病毒基因治疗带来了新的希望。
HBV为3.2kb的DNA病毒，负链DNA有四个开放读码框架（ORF），分别称为S、C（core）、P和X。X与0.9kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb、3.9kb的mRNA转录有关，而core仅与3. 5kb、3.9kb的mRNA转录有关。为探讨siRNA抗HBV的作用，Harvard大学免疫学家Lieberman J和Shanker P等 ［18］ 最先在动物模型中揭开RNAi治疗疾病的能力，相当于小鼠血容量一半的siRNA的溶解物注入小鼠尾巴以保护小鼠免受肝炎损害。以色列学者Shlomai和Shaul［19］ 设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体:pSUPERX-siRNA（1649位～1667位nt）和pSUPERcore-siRNA（2191位～2209位nt）。实验中将pSUPERX-siRNA和HA-X载体（表达X）或pSUPERcore-siRNA和HA-core载体（表达core）共转染Huh7细胞，72h后X、core蛋白的表达相应显著降低。已转染含1.3×wtHBV基因质粒载体的Huh7细胞再被X-siR-NA或core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。为进一步验证实验结果，他们又用pSU-PERX质粒转染能稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞，72h后用共聚焦显微镜可以观察到经免疫染色的core蛋白表达水平显著下降。紧接着日本学者HamasakiK等 ［20］ 用化学合成的针对HBVC区21个核苷酸的siRNA（小干扰性RNA）转染细胞取得相似的结果。结果显示siRNA明显降低了相应的HBV转录体和蛋白水平。
1.4 RNAi在HCV中的研究进展 丙型肝炎病毒（HCV）为单股正链RNA病毒，病毒基因组既是复制的模板，又是mRNA。Kay等通过体外试验以及在表达抗
丙肝的siRNA遗传工程小鼠的实验证明，这项技术可以在体内有效的阻碍病毒复制。McCaffrey等 ［21］ 报道了siRNA抑制成年小鼠转基因表达的作用，且能作用于丙肝病毒特定序列。siRNA用来对抗NS5B（非结构蛋白5B，病毒多聚酶编码区域）亦有效。同样是McCaffreyAP实验室，他们发现，在感染HCV的转基因小鼠体内，针对HCV NS5B的siRNA能够抑制HCV的复制。Randall等 ［22］ 证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍;将siRNA转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用。Kapadia等 ［23］ 证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。Glenn等 ［24］ 用支持HCV复制但不会产生有感染病毒颗粒的系统，研究了siRNA能否沉默细胞质中HCV复制的表达。结果显示，细胞中Lami-nA/C和HCV RNAs被有效地沉默。而且HCV RNA沉默具有剂量依赖和系列特异性。美国Rockfeller大学Rice实验室的研究人员的研究表明，siRNA能“治愈”98%丙型肝炎患者的肝细胞（即消除病毒复制）。该法是用电穿孔技术转染细胞，认为这对于预防肝移植受者的肝炎再感染可能非常有用。
1.5 RNAi在抗SARS中的的研究进展 SARS冠状病毒（SARS Cov）是目前严重危害全球人类健康、社会稳定和经济发展的非典型传染性肺炎的病原
微生物.是目前发现的最大的RNA病毒。目前已知其编码4个主要结构蛋白:核壳体蛋白（N）、突起蛋白（S）、膜蛋白（M）以及小包膜蛋白（E），还有一些未确定蛋白 ［25］ 。Lin等［26］ 针对SARS病毒S蛋白的RNAi设计，以S蛋白为目标选取16个RNA干涉的耙序列，并设计用于体内转录形成以U6启动子的siRNA发夹结构的DNA，将设计的DNA瞬时转染耙细胞，用定量RT-PCR法确定目标RNA被干涉的程度，用Western blot在蛋白质水平上进行监测，效果较为乐观。其工作的开展将在RNAi治疗SARS冠状病毒、新药开发等方面发挥了重要作用。liu等 ［27］ 基于NCBI公布的SARS冠状病毒全基因组序列，应用计算机模拟预测SARS冠状病毒的单链RNA的二级结构，并对其进行分析，预测出应用RNAi技术作用于二级结构的可能的特定区域，从而为设计基于RNAi技术阻断SARS冠状病毒转录或蛋白质表达的治疗药物提供指导.针对SARS-CoV基因组保守序列的RNAi，沉默的将不仅仅是个别基因的表达，而是几乎所有基因的表达，直接给病毒致命一击。
1.6 RNA干扰抗其它病毒、疾病的研究进展 除了HIV、HBV、HCV以外，科研人员还开展了其它许多病毒性疾病的RNAi研究。例如，HuWY等 ［28］ 证明了siRNA能阻抑逆转录Rous肉瘤病毒（RSV）感染脊椎动物;Leonid等发现针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或编码病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒复制，加速清除受染细胞中的脊髓灰质炎病毒;Gitlin等 ［29］ 发现在Hela细胞里，双链短RNA减少脊髓灰质炎病毒的复制，提高被感染细胞的病毒清除率Jia等 ［30］ 发现Rta-siRNA和ORF45-siRNA能特异阻止疱疹病毒复制。另外，siRNA也对呼吸道合胞病毒（RSV）、人类乳头瘤病毒（HPV）的感染有抑制作用。约翰·霍普金斯大学的David等 ［31］ 研究人员通过引入RNAi技术发现了胆红素强大的抗氧化作用，有可能替代谷胱甘肽而成为治疗新一代几乎所有因氧化胁迫而导致细胞损伤和死亡的方法。爱达荷大学的研究小组 ［16］ 通过siRNA降低了多谷氨酸链延伸疾病，包括脊髓小脑共济失调（spinocerebel-laratacias）和亨廷顿氏舞蹈病等，都是由多谷氨酸链的延伸增加引起的。美国西北大学的Carthew RW ［32］ 和日本基因研究所的Ishizuka A等人 ［33］ 几乎在同一时间发现了RNAi同脆性X染色体综合征，一种与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制，成为当今研究RNAi的又一大热点。
2 讨论
RNAi技术的应用将引起生命科学领域革命性的变化，已成为生命科学研究中的新热点。RNAi技术作为1个抑制基因表达的免疫机制，在抗病毒感染方面有许多优点:（1）特异性针对病毒转录产物从而阻断病毒复制，不会激活非特异性细胞反应，因此将
不良反应降到最小;（2）RNAi具有高效性，少量的siRNA就可降低病毒表达产物的作用;（3）RNAi可以针对病毒基因保守区发挥作用，从而限制了病毒产生逃避突变株的能力;（4）siRNA可以在病毒非活跃复制的情况下发挥其抑制病毒基因转录及降低蛋白表达水平的作用。
尽管RNAi技术具有如此明显和专一的优点，但仍有其缺陷:Fraser等 ［34］ 在RNAi的研究中，发现RNAi不能作用于所有的基因和某些细胞类型（如神经元）;一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显;如果几个基因有相同或者近似的序列，RNAi会同时作用它们，这样，所观察到的表型就不能肯定是由哪些基因被干扰所产生的。在医学上RNAi主要用于抗RNA病毒的感染，而对DNA病毒的尝试很少，以RNAi的作用机制来看，RNAi技术同样可以用于DNA病毒的防治。另外，对RNAi的研究是在体外培养细胞中进行，离
临床运用还有一段距离。相信随着人们对RNAi研究的深入，利用siRNA技术可以成功地开发作为肿瘤，病毒治疗的药物，利用RNAi技术来治疗遗传性疾病、病毒感染、免疫缺陷疾病和肿瘤等重大疾病。
参考文献 1 Zhu Rui，Zhang Kai-li，Zou Xiang-yang.RNA interference technique and dusing in study of functional genomics.Journal of DaLian Medical University，2003，2（25）:105-107.
2 康洁，刘福林.RNAi，生物体内的基因免疫.生物学通报，2004，8（39）:16-17.
3 Fire A，Xu S，Montgometry MK，et al.Potent and specific genetic inter-ference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature，1998，391（6669）:806-811.
4 Wilda M，Fuchs U，Wossmann W，et al.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference.Oncogene，2002，21（37）:5716-5724.
5 Cioca D P，Aoki Y，Kiyosawa K.RNA interfering is a functional path-way with therapeutic potential in human mycloid leukemiaceu lines.Can-cer Gene Therapy，2003，10（3）:125-133.
6 Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.Stable suppression of tumori-genicity by virus mediated RNA interference.Cancer Cell，2002，（3）:243-247.
7 Elbashir S M，Harbotth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of21-nu-cleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature，2001，411（836）:494-498.
8 Lin S L，Chuong C M，Ying S Y.A novel mRNA-cDNA interference phenomenon for silencing bel-2expression in human LNCaP cells. Biochem Biophys Res Commun，2001，281（3）:639-643.
9 Schrijver ED，Brusselmans K，Heyns W，et al.RNA interference mediat-ed silencing of fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cell.Cancer Res，2003，63（6）:3799-3804
10 Jiang M，Milner J.Selective silencing of viral gene expression in HPV-positive human cervical carcinoma cells trested with siRNA，A pimer of RNA interference.Oncogene，2002，21（39）:6041-6048.
11 Liposcomb E，Dugan AS，Rabinovita I，et al.Use of RNA interference to inhibit integrim（α6β4）mediated invasion and migration of breast carcinoma cells.Clinical Experimental Metastasis，2003，20（3）:569-576.
12 Romosnino ME，Sxapoli L，Martinelli M，et al.Microarray analysis and RNA silencing link fral-1to cd44and c-met expression mesothe-liomal.Cancer Res，2003，63（13）:3539-3545.
13 Capadici J，Kariko K，Weissman D.Inhibition of HIV-infection by small interfering RNA mediated RNA interference.Immunol，2002，169（11）:5196-5201.
14 Jacque J M，Triques K，Stevenson M.Modulation of HIV replication by RNA interference.Nature，2002，418（6896）:435.
15 Novina CD，Murray MF，Dykxhoorn DM，et al.siRNA-directed inhi- bition of HIV-1ingection.Nature Med，2002，8（7）:681.
16 Xia Haibin，Mao Qinwen，Henry L，Paulson，et al.siRNA-mediated gene silencing invitro and invivo.Nature Biotech，2002，20（10）:1006-1010.
17 Kao J H，Chen D S.Global control of hepatitis B virus infection.Lancet Infect Dis，2002，2:395-403.
18 Liberman J，Couzin J.Mini RNA moleculars shield mouse liver from hepatitis.Science，2003，299（3）:995.
19 Shlomai A，Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference.Hepatology，2003，37:764-770.
20 Hamasaki K，Nakao K，Matsumoto K，et al.Short interfering RNA di-rected inhibition of hepatitis B virus replication.FEBS Lett，2003，543:51-54.
21 McCaffrey AP，Nakai H，Pandey K，et al.Inhibition of hepatitis C virus in mice by RNA interference.Nat Biotechnol，2003，21:639-644.
22 Randall G，Grakoui A，Rice C M.Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs.Proc NatI Sci，2003，100:235-240.
23 Kapadia S B，Brideau Anderen A，Chisari F V.Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs.Proc NatI Acad Sci，2003，100:2014-2018.
24 Glenn R，Grakoui A，Ticecal.Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs.Proc NatI A- cad Sci USA，2003，100（1）:235-240.
25 Wu Feng，Chen Hui-peng.Silencing genes by RNAi in SARS-CoV. Letters in Biotechnology，2003，3（14）:252-253.
26 Lin Jian-ping，Yu Yong-li，Wang Li-ying.RNAi design to the S protein of SARS-CoV.Letters in Biotechnology，2004，4（15）:335-337.
27 Liu Ping-ying，Liu Zhi-xue，Guo Jing-kang.Computer simulation of RNA secondary structures of SARS virus and prediction of target sites of RNAi action.Journal of ShangHai University（natural science），2004，4（10）:435-440.
28 Hu W Y，Myers C P，Kilzer J M，et al.Inhibition of retroviral patho-genesis by TNA interference.Current Biology，2002，12（15）:1301-1311.
29 Gitlin，Karelsky S，Andino R.Short interfering RNA confers intracellu-lar antivural immunity in human cells.Nature，2002，418（6896）:430-434.
30 Jia Q，Sun R.Inhibition of gammaherpesvirus replication by RNA inter-ference.Journal of Virology，2003，77（5）:3301-3306.
31 David E，MahilRao，Christopher D，Terris，et al.Biliverdin reductase;Amajor physiologic cytoprotetant.Proc NatI Acad Sci，2002，25:16093-16098.
32 Carthew R W.RNA interference:the fragile X syndrome connection，Curr boil，2002，12（24）:852-854.
33 Ishizuka A，Siomi MC，Siomi H.A drosophila fratile X protein interacts with components of RNA and ribosomal proteins.Genes Dev，2002，16（19）:2497-2508.
34 Fraser A G，Kmath R S，Zipperlen P，et al.Functional genomic analysis of C elegans chromosome1by systematic RNA interference.Nature，200，408:325-330
作者单位:571101海南海口中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室
571101海南海口中国热带农业科学院热带生物技术研究所（△ 责任作者）
作者：
苗灵凤 杨帆 张树珍 2005-7-26