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【摘要】 目的 探讨外标四点法的可行性。方法 HPLC法，色谱柱：ALLTECH C18(4.6mm×250mm,5μm)，流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：85)，流速1.0ml/min，ELSD参数：漂移管温度108.0℃；载气(压缩空气)流速3.10L/min。结果 外标四点法得出回归方程，经统计学方法证明成立，且相关系数r显著。结论 外标四点法可以用于银杏萜类内酯的含量测定。
【关键词】 银杏叶萜类内酯；含量测定；HPLC-ELSD；外标四点法
Study on reliability of ESM of four points to determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones
HUANG Zhe-wen,TANG Qin-qiang,WANG Cun-fang.Shenzhen Neptunus Pharmaceutical and Technologic Co.,Ltd,Shenzhen 518057 ,China
【Abstract】 Objective Study on the reliability of ESM of four points.Methods HPLC system consisting of an Alltech C18 column(4.6mm×250mm,5μm),and the mobile phase was n-Propyl alchol,tetrahydrofuran and water (1:15:84) at flow rate of 1.0ml/min.The detector temperature was 108.0℃ and the dry gas flow rate was 3.10L/min.Results The ESM of four points has been established.Conclusion The ESM of four points can be used on determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones.
【Key words】 ginkgo terpene lactones;assay;HPLC-ELSD;ESM of four points
有关银杏叶中萜类内酯的含量测定方法的报道较多，目前银杏叶制剂的萜类内酯含量测定方法采用的多为HPLC法［1～3］。我们亦采用2005版中国药典收录的HPLC法［4］，蒸发光散射检测器进行测定。HPLC-ELSD使用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏叶内酯A、银杏叶内酯B和银杏叶内酯C的含量，四种银杏内酯的含量之和为萜类内酯含量。我们在实际工作中使用外标两点法时，直接从数值上难以判断对照溶液的配制是否准确，及其外标两点法对应的工作曲线(n＝2)是否可靠。因此，同时配制两份对照溶液各自分别测定5μl、10μl两点，将四个浓度和相应峰面积一条标准曲线（n＝4），得出回归方程及相关系数r，通过统计学方法考察曲线和回归方程是否成立［5］。
1 仪器与试药
1.1 仪器 高效液相色谱仪：SHIMADZU-10A；蒸发光散射检测器ALLTECH ELSD2000。
1.2 试药 白果内酯，银杏叶内酯B、银杏叶内酯C对照品购于中国药品生物制品检定所；银杏叶内酯A对照品购于SIGMA。甲醇为色谱纯；水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：ALLTECH C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：84)；流速1.0ml/min；ELSD参数：漂移管温度108.0℃；载气(压缩空气)流速3.10L/min；柱温35℃；进样量5、15μl。理论塔板数按白果内酯峰计算应不低于2500，相邻峰的分离度应＞1.5。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的白果内酯、银杏叶内酯A、银杏叶内酯B和银杏叶内酯C对照品适量，置同一10ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，混匀，即得。
2.2.1 对照品溶液一 白果内酯22.73mg、银杏内酯A 13.42mg、银杏内酯B 11.13mg和银杏内酯C 9.05mg。
2.2.2 对照品溶液二 白果内酯14.71mg、银杏内酯A 11.34mg、银杏内酯B 12.24mg和银杏内酯C 18.99mg。
2.3 外标四点法直线回归方程的确定 分别精密吸取对照品溶液一和二5μl、15μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图。结果：对照溶液中白果内酯(tR＝8.375)、银杏叶内酯A(tR＝9.811)、银杏叶内酯B(tR=12.040)和银杏叶内酯C(tR＝7.194)，相邻组分分离效果良好(见图1)。浓度与峰面积的数据及处理见表1。
以对照品浓度的自然对数InC(x)为横坐标，峰面积的自然对数InA(y)为纵坐标作图，见图2～5。
图中四点有成一条直线的趋势，在直线方程y＝ax+b中，通过统计计算按公式1、2、3分别求出两个常数a，b及直线的相关系数r，见表2。
图1 萜类内酯对照溶液HPLC图 略
表1 对照进样量(μg)与峰面积 略
图2 略
2.4 直线回归方程的统计学检验
2.4.1 相关系数检验法 相关系数表示两变量间关系的密切程度。使用相关系数检验法来进行相关系数的显著性测验。见表2。
表2 回归方程和相关系数r计算结果以及r的t值 略
2.4.2 t检验法进行相关系数r的显著性测验t检验法进行相关系数的显著性测验，公式4如下：t＝r×n-2 1-r2 n-自由度公式4
t＞t(n-2),0.01时，x(InC)与y(InA)间的相关关系有非常显著意义。查表得t（２）０．０１＝９．９３。表2中t均＞t(2)0.01,所以认为x(InC)与y(InA)之间存在线性相关关系。外标四点对数方程法的直线可确立。
2.4.3 外标四点法的重复性考察 取对照一与对照二，按照标准曲线的制备进行六次实验，分别得到六组标准曲线及相关系数r，见表3。
表3 外标四点法所得回归直线的比较 略
3 结论
实验数据中外标四点法对应的标准曲线相关系数均大于r0.01，4＝0.990，线性相关且回归方程是有意义的。在实验得到的回归方程当相关系数＞0.990时可用计算内酯的含量，该方法增加了标准曲线的可靠性，可有效控制制剂的质量。
【参考文献】
1 Mark Blumenthal.German government limits Ginkgoliv lactone levels in ginkgo leaf.Herral Gram,1997,(41):29.
2 Zhang L,Chen XP,Dong XP,et al.Determination of Ginkgo lactone in Ginkgo capsules by HPLC (HPLC法测定银杏叶胶囊的含量).Jiangsu Pharmacy and Clinical Research(江苏药学与临床研究)，2004，12(1)：29-32.
3 Tang JW.Determination of Ginkgo lactone in Kangmailing capsules by HPLC (HPLC法测定康脉灵胶囊中银杏萜内酯的含量).Tianjin Pharmacy(天津药学)，2005，17(1)：11-13.
4 Ch P.(中国药典).Vol I.2005.
5 蒋子刚，顾学梅.分析检验的质量保证和计量认证.上海：华东理工大学出版社，1998，50-210.
作者单位： 518057 广东深圳，深圳海王药业有限公司
(编辑：守 中)