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【摘要】 目的 探索研究几种水溶性维生素（VitB1、VitB6、VitB12 and VitC）对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用。方法 采用改良的MTT法，来检测小鼠腹腔巨噬细胞活性。结果 VitB1 50μl (0.0025μg), VitB6 200μl (0.002μg), VitB12 200μl (0.002μg), VitC 200μl(0.08μg)均对小鼠腹腔巨噬细胞有活性增强作用。结论 几种水溶性维生素（VitB1、VitB6、VitB12 and VitC）对小鼠腹腔巨噬细胞活性有增强作用。
【关键词】 水溶性维生素；MTT法；小鼠巨噬细胞
To study the activation of in vitro mice macrophages with various water soluble vitamins
ZHAO Dong , WANG Ke, GAO Yan,et al.
Department of Immunology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100089, China
【Abstract】 Objective To propose studying the effect of various water soluble vitamins ( VitB1,VitB6,VitB12 and VitC ) of in vitro mice macrophages activation. Methods The article took the modified method of MTT to explose the activation of in vitro mrice macrophages. Results VitB150μl (0.0025μg), VitB6 200μl (0.002μg), VitB12 200μl (0.002μg), VitC 200μl(0.08μg) all stimulated the effect of in vitro mice macrophages. Conclusion Various water soluble vitamins( VitB1,VitB6,VitB12 and VitC )which were able to stimulate the activation of in vitro mice macrophages under certain concentration.
【Key words】 water soluble vitamin; MTT method; mice macrophage
维生素是维持人体正常生理功能及细胞内各种能量代谢生化反应所必需的一类低分子量有机化合物。尽管机体对这类物质需求量相对很少，但是它们却十分重要，是人体必不可少的微量物质，如果缺乏，可引起各种各样的疾病。因此某些种类维生素对人体的免疫系统的免疫功能也起着重要作用，影响免疫系统的各种细胞功能。最近许多年，国内外营养免疫学者都在研究探讨各种维生素对免疫系统的作用，企图探明各种维生素对免疫细胞活化的增强或抑制，为提高机体免疫力，本文选用和人类基因组具有相当部分同源性小鼠，选用 体外实验检测维生素B1、B6、B12和维生素C对小鼠腹腔巨噬细胞活性作用的研究。 Mosmon(1983)［1］报道噻唑蓝（MTT）比色法，经后人改良，使这种方法更加完善成熟，成为定量、重复性好、简便易行检测免疫细胞活性的好方法。我们采用此法，检测小鼠腹腔巨噬细胞的活性，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 实验动物和主要试剂及实验仪器 ICR小鼠体重（20±2）g，雄性，由首都医科大学实验动物部提供。RPMI1640培养液为Hyclmone公司产品。噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品，10%十二烷基磺酸钠（SDS）为BRL公司产品，淋巴细胞分离液为TBD生物技术发展中心产品，液体石蜡油为北京旭东化工厂产品， VitB1 （5mg/ ml）、VitB6 （5mg/ ml）、VitB12 （0.5mg/ ml）均为天津金耀氨基酸有限公司产品， VitC（400mg/ ml）为北京双鹤药业有限公司产品，酶标仪为SLT公司产品（型号为A-5082）。
1.2 方法 （1）对小鼠腹腔注射（VitB1 、VitB6 、VitB12 和VitC，无菌液体石蜡油），取ICR小鼠40只分成4组，每组10只，分别为1组、2组、3组和4组。1组为VitB1实验组，第1天对其中5只小鼠腹腔注射无菌生理盐水 0.2ml/只，作为对照，另外5只小鼠腹腔注射VitB1 0.05ml/只作为实验组。2组为VitB6 实验组，第1天对其中5只小鼠腹腔注射无菌生理盐水 0.2ml/只，作为对照，另外5只小鼠腹腔注射VitB6 0.2ml/只作为实验组。3组为VitB12 实验组，第1天对其中5只小鼠腹腔注射无菌生理盐水 0.2ml/只，作为对照，另外5只小鼠腹腔注射VitB120.2ml /只作为实验组。4组为VitC 实验组，第1天对其中5只小鼠腹腔注射无菌生理盐水 0.2ml /只，作为对照，另外5只小鼠腹腔注射VitC 0.2ml/只作为实验组。以上4组小白鼠经腹腔注射生理盐水和维生素，均于48h后再经腹腔注射无菌液体石蜡油0.1ml /只。48h后行颈椎脱臼处死。（2）巨噬细胞的制备：将处死的小白鼠行腹部皮肤消毒后，持镊提起腹中部皮肤并剪开，暴露腹膜，避开血管剪开腹膜一小口。用毛细吸管取出腹腔液，并收集于试管中。作好标记后离心，弃上清，洗3次，立即进行台盼蓝染色，计算活细胞数。细胞数108/ ml。（3）噻唑蓝比色法，将制备的小鼠巨噬细胞按组分管，每组实验管（孔）3管（孔）对照管（孔）3管（孔）。37℃温育2h后，每管加10%SDS（溶于双蒸水），轻轻震荡，待甲簪颗粒完全释放后，再用酶标仪测OD570值。
2 结果
2.1 VitB1对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用 VitB1对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用，VitB150μl（0.0025μg）对小鼠腹腔巨噬细胞活性有增 强作用，P<0.01，见图1。
图1 Vit B1对小鼠巨噬细胞活性的作用（略）
2.2 VitB6对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用 VitB6对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用, VitB6200μl(0.002μg）对小鼠腹腔巨噬细胞活性有增强作用，P<0.01，见图2。
图2 Vit B6对小鼠巨噬细胞活性的作用（略）
2.3 VitB12对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用 VitB12对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用，200μl(0.002μg)对小鼠腹腔巨噬细胞活性有增强作用，P<0.001，见图3。
图3 Vit B12对小鼠巨噬细胞活性的作用（略）
2.4 VitC对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用 VitC对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用，200μl(0.08μg)对小鼠腹腔巨噬细胞活性有增强作用，P<0.01，见图4。
3 讨论
Mosmon （1983年）［1］报道噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞活性。MTT可被各种类型的活性细胞（RBC除外）摄取，活性强的细胞摄取较多的MTT，在线粒体内被脱氢酶还原为甲簪颗粒（Formazan）,颜色由黄变深紫，加入SDS使细胞完全裂解释放出甲簪，在波长570nm下酶标仪测量OD值，
图4 VitC对小鼠巨噬细胞活性的作用（略）
OD值越高，其甲簪浓度越高，反应活的细胞活性越强［2，3］。因此，MTT法可定量检测各种细胞的活性。我们曾经报道 几种水溶性维生素对小鼠淋巴细胞活性的作用［4］。本报道VitB1、VitB6、VitB12 和VitC对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用，它们在一定浓度下对小鼠腹腔巨噬细胞活性有增强作用，VitB12 尤为显著。VitB1、VitB6、VitB12 均涉及体内细胞正常生理生化功能，因此，它们当然参与小鼠腹腔巨噬细胞的生化反应，完成正常生理功能。VitC经临床实验证实［5］，它具有抗氧化作用，增强巨噬细胞的吞噬杀菌功能，并有增强淋巴细胞功能（曾已报道）的VitC还参与免疫球蛋白的二硫键的形成，从而促进免疫球蛋白的合成。有增加补体C1和干扰素的产生，以及增强NK细胞的活性，因此增强人体抗肿瘤的作用［6，7］。
营养免疫是当今热门的研究课题之一。人体许多种疾病都涉及免疫系统，免疫系统有防御、监视、耐受和调节功能。各种营养素，是人体依存最为重要的环境因素，也是维持人体正常免疫功能和健康的物质基础。各种维生素虽然人体每日需要量很少，它们常以辅酶或辅基的形式参与酶的功能，尤其是B族的维生素，因此它们在调节人体物质代谢过程中起着关键的作用。研究各种维生素对人体免疫系统的作用是营养免疫的重要任务。
【参考文献】
1 Mosmann,T.Repid colorimetric assay for cellular growth and surviral application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Meth，1983, 65：55-63.
2 陈哲生.噻唑蓝比色法检测细胞的活性.上海医学检验杂志，1994，9（4）：205-206.
3 陈哲生.噻唑蓝比色法用来研究人类淋巴细胞和小鼠巨噬细胞细胞的活性. 上海免疫学杂志,1992,12 (5)：269-317.
4 孙明洁.几种水溶性维生素对小鼠淋巴细胞活性的作用.中华中西医杂志,2005，21（6）：2805-2806.
5 荫士安，汪之琐主译.现代营养学 .第八版 .北京：化学工业出版社，2004，213-285.
6 徐世侠，吴育云.补充维生素A和维生素C对营养缺乏所致免疫功能低下的影响. 中国公共卫生,1998，14（12）：741-743.
7 杜卫东,沈道明,黄春锦,等.大剂量维生素C对急性胰腺炎患者细胞免疫功能的影响.胃肠病学, 2002, 7 (4)： 213-215.
作者单位：100089 北京，首都医科大学
(编辑：悦 铭)