点击显示 收起
【摘要】 目的 采用抗丙型肝炎病毒（HCV）第一高变区（HVR1）抗体，建立病毒捕获实验。方法 重组表达HVR1嵌合抗原，免疫家兔，制备抗HVR1抗体，与20例患者阳性血清反应，通过HCV RT-PCR检测捕获结果。结果 在30例样品中有13例完全捕获，16例部分捕获 ，仅1例未捕获。结论 抗HVR1多抗可高交叉捕获HCV病毒。
【关键词】 肝炎病毒丙型； 互补决定区抗体； 聚合酶链反应
Studies on the antibodies against hypervariable 1(HVR1) of hepatitis C virus (HCV) capture virus
CHEN Kun, XIU Bing-shui, WANG Guo-hua,et al.
Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
【Abstract】 Objective A set of test capture virus was formulated. Using antibodies against hypervariable 1(HVR1) of hepatitis C virus (HCV). Methods Recombinant expression antigens of chimeric HVR1, the preparation of antibodies against HVR1 by immuno-rabbit,with 30 cases patients of HCV infection capture test，the results were detected by HCV RT-PCR. Results In 30 cases of HCV infection can capture virus of 13cases completely, 16 cases capture partly,only 1case can not capture. Conclusions The antibodies against hypervariable 1(HVR1) of hepatitis C virus (HCV) can broadly capture virus of HCV.
【Key words】 hepatitis C virus; complementarity determining regions antibody; polymerase chain reaction
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的世界性传染病。研究表明，约70％～85%的HCV感染将发展为慢性肝炎，其中部分最终将发展成为肝硬化和肝细胞癌，是极为严重的世界公共卫生问题。而目前仍没有有效的治疗和预防的方法，问题在于HCV变异大，而中和性表位所在的HVR1区变异更大，变异引起的免疫逃逸，要获得有效的免疫几乎不可能。但最近研究表明，HVR1虽然高变，但仍有一定规律性，存在着一定的免疫交叉反应性，又为这方面研究带来一线曙光。于是就出现了有关高交叉反应性HVR1的研究，也取得了可喜的结果。Zibert［1］等证明HVR1-Ab能有效捕获同株病毒粒子，Zhou［2］等证明HVR1-Ab能阻止同株病毒吸附于培养细胞上。本研究用克隆表达的交叉性HVR1作为免疫原，制备抗HVR1抗体，对20份病人血清进行了体外捕获病毒实验，获得了满意的结果。
1 材料与方法
1.1 融合多片段HVR1抗原及抗HVR1体的制备［3］ 通过用生物信息学手段，从国内外已报道的123条HVR1序列，挑选了12条代表性HVR1序列，通过用酶联免疫对丙 肝患者 血清进行筛选，最终确定4条具有高交叉反应性的优势HVR1串联，克隆表达获得高交叉反应的HVR1抗原。将纯化的HVR1融合蛋白，免疫雄性大耳白家兔，皮下注射1 ml混合有完全弗氏佐剂1mg HVR1融合抗原，21、42天后用混合有不完全弗氏佐剂1mg HVR1再加强1次，51天后，耳静脉取血测效价，达到所需抗体效价要求后，颈总动脉取血。采用ELISA法对免疫动物血清的效价进行测试。
1.2 血清样品 30例临床确认的丙型肝炎患者血清。
1.3 抗HVR1抗体捕获病毒试验
1.3.1 常规捕获病毒试验 HCV RNA阳性血清用PBS 1：50稀释，4℃离心 16000r/min×15min。取上清50μl,加入免疫兔抗HVR1血清（1mg/ml）5μl，4℃孵育4 h。加入50μl羊抗兔IgG，4℃孵育1.5h,4℃离心2800r/min×15 min 取上清和沉淀分别做RNA检测。
1.3.2 样品经预处理后捕获病毒试验 取HCV RNA阳性血清100μl,加样品预处理液50μl（0.3%Triton X-100 30μl;1.5 CHAPS 0.15g; 15%SDS 1.5g; PBS 10ml）;混合均匀，37℃,30 min。其他试验步骤同常规处理方法。
1.4 HCV RNA的检测方法(所用试剂购于中国华美生物工程公司)
1.4.1 HCV RNA的提取 取0.5 ml 离心管，加入HCV阳性血清50μl、裂解液400μl、样品处理液20μl,振荡混匀，室温静置30 min，期间数次振荡混匀。离心 12000 r/min×1 min。弃上清， 加70%的乙醇400μl,振荡混匀，离心12000 r/min ×1min。重复上述过程，用70℅的乙醇再洗一次。置56℃烤箱20min烤干。
1.4.2 逆转录 将RT试剂根据待测样品按如下混合, DDH2O 12.5μl，5×AMV buffer 6.0μl，25 mmol/L MgCl2 4.8μl， 10 mmol/L dNTP 3.0μl, 1 F 1.5μl，1 R 1.5μl， RNasin 0.3μl，AMV 0.4μl，每管加RT反应液30μl,43℃ 45min,期间数次混匀之后, 95℃ 5min灭活,立即冰浴5min。离心 8000 r/min×2 min，取上清5μl备用。
1.4.3 HCV PCR扩增 1stPCR每管用量，DDH2O 16.2μl， 10×PCR buffer 2.5μl，25 mmol/L MgCl2 1.0μl，Taq 0.3μl．取上述逆转录反应产物5μl/管和 1stPCR 反应液20μl，95℃变性2min，95℃， 60s 、55℃ ，60s、72℃，60s共30个循环。 2ndPCR 每管用量, DDH2O 17.55μl， 10×PCR buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl2 1.5μl，4mmol/L dNTP 0.25μl，2 F 0.25μl，2 R 0.25μl， Taq 0.2μl。2次PCR扩增每管加上述混合液22.5μl和2.5μl 1stPCR 反应产物，95℃，60s、55℃，60s、72℃，60s共32个循环。
1.5 电泳鉴定 取5μl 2次PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，PCR产物片段大小为145 bp。
1.6 定量HCV PCR 试剂为中山医科大学达安基因股份有限公司生产的丙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒。在逆转录后，PCR扩增样本同时，加入系列稀释的定量标准品，依次为102、103、104、105、106，将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数定量计算，确定HCV RNA的拷贝数。
1.7 捕获病毒试验结果判断 仅上清中检测到RNA说明未捕获病毒；仅沉淀中检测到RNA说明病毒完全被捕获；上清和沉淀中都检测到RNA说明部分捕获。
2 结果
2.1 抗HVR1捕获病毒 在30例HCV阳性血清，经预处理后抗HVR1抗体捕获病毒结果，结果7例HCV RNA 104完全捕获， 14例105有6例完全捕获，8例部分捕获，9例106中有8例部分捕获，1例未捕获,见表1。
表1 30例HCV阳性血清中抗HVR1抗体捕获病毒实验结果 略
2.2 血清样品常规和经预处理后的比较 对11例样品常规处理和经预处理后进行了比较，其中7例常规处理后捕获结果为仅上清检测阳性，沉淀为阴性，经预处理后6例上清和沉淀均为阳性, 1例预处理后与常规结果一致；3例部分捕获的样品经预处理后检测仅沉淀阳性，上清阴性;而有1例上清阴性，沉淀阳性，预处理后上清和沉淀均为阳性,见表2。
表2 对血清样品常规和经预处理后的比较结果 略
3 讨论
只通过少数HVR1肽获得的交叉反应性毕竟还有限。我们应用生物信息学计算机分析和实验验证相结合，筛选出高交叉反应性HVR1加以组合表达，以期真正解决HVR1高变的问题。 我们通过改进摸索出用抗HVR1抗体捕获病毒的试验方法［5］，对30例临床丙肝阳性的患者用抗HVR1的抗体捕获病毒，捕获率达96%，而文献报道仅为65%［5］ 。
通过对HCV RNA的浓度与捕获效果的分析发现，在104～105 Copies/ml捕获效果比较好，而106捕获效率下降。分析捕获效率可能与病毒滴度有关［4］。
通过改进捕获试验，我们体会到，样品保存最好新鲜,分装-70℃保存； 模板提取必须防止污染;抗体、RNA阳性样品， 如捕获结果只有上清阳性,沉淀阴性，不能说明未捕获到, 有可能是因为抗原-抗体复合物存在,无游离的病毒,需经预处理使解离抗原抗体复合物，增加病毒的捕获效果［5］。
【参考文献】
1 Zibert A E, Schreier M.Roggendorf. Antibodies in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block viral attachment. Virology,1995, 208:653.
2 Zhou YH, Takekoshi M, Maeda F, et al.Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis C virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro. Antiviral Res，2002，5651-5659.
3 修冰水，凌世淦，宋晓国，等. 丙型肝炎病毒第一高变区(HVR1)免疫交叉性研究. 军事医学科学院院刊， 2002，26：93-95.
4 Shang DZ，Zhai WW，Allain ，et al.Broadly cross-reactive，High-affinity antibody to hypervariable region 1 of the hepatitis C virus in Rabbit. Virology，1999，258：396-405.
5 Zhu H, Wang SY, zhang JY, et al.Analysis of complement-bound HCV complexes using a novel immuno-capture RT-PCR method.Scand J Immunol,2002,56:538-542.
作者单位:1 100850 北京, 军事医学科学院基础医学研究所(Δ通讯作者)
2 050017 河北石家庄,河北医科大学免疫教研室
(编辑：宋 冰)