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【摘要】 目的 研究SD大鼠维甲酸灌胃骨质疏松模型中血清hepcidin含量的变化。方法 取72只大鼠分为模型组和对照组，模型组以维甲酸70mg/（kg·d）持续灌胃14天，对照组等量蒸馏水灌胃14天，双能X线骨密度仪器进行活体骨密度测定，模型组和对照组血清hepcidin含量ELISA试剂盒进行测定。结果 骨密度的测定显示骨质疏松模型组骨密度较对照组降低，差异有显著性。模型组和对照组相比较，血清hepcidin含量在模型建立过程中有变化：初期略有降低，差异无显著性；中期明显降低，差异有显著性；后期略有回升，低于对照组，差异无显著性。结论 血清hepcidin含量变化与维甲酸致骨质疏松形成可能存在直接或间接关系，hepcidin的变化可能成为骨质矿化异常诊断、治疗的新焦点，为进一步研究骨质疏松提供新的思路。
【关键词】 骨质疏松 维甲酸 铁调素 血清
Observation of changes of serous hepcidin concentration in SD rats osteoporosis model
MA Yong, XU You-jia, QIAN Zhong-ming, et al. Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China
【Abstract】 Objective To investigate the changes of serum hepcidin concentration in SD rats osteoporosis model induced by intragastic administration with tretinoin. Methods 72 SD rats were divided into experimental group and control group randomly, treated the experimental group with tretinoin and the control group with distilled water of equal quantity by intragastic administation for lasted 14 days, assayed the bone density with dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) and serum hepcidin concentration of experimental group and control group with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The assay of bone density indicated that bone density of experimental group was much lower than control group. In contrast to control group, serum hepcidin concentration of experimental group changed in the formation process of osteoporosis model. The serum hepcidin concentration decreased slightly with no significant difference at early stage, decreased obviously with significant difference at intermediate stage. But increased slightly at late stage, still lower than concentration of serum hepcidin of control group, decrease was of no statistics meaning. Conclusion The changes of serum hepcidin concentration may have direct or indirect relation with osteoporosis formation induced by intragastic administration with tretinoin. Perhaps hepcidin investigation will become a new focus point in diagnosis and treatment of bone mineralization abnormality and make great progress in studying osteoporosis.
【Key words】 osteoporosis；tretinoin；hepcidin；serum
近几年来，许多研究结果认为体内铁代谢平衡和紊乱与骨质矿化有着密切的联系。在研究绝经女性骨质疏松治疗、预防时发现铁的摄入与骨的矿化密度呈正相关［1,2］。Denis M. Medeiros等研究发现铁缺乏饮食的骨矿化不良［3］。Margaret M. Harris等［4］研究结果显示绝经后妇女的饮食铁摄入增加可以提高骨密度。
铁调素（hepcidin）是一种富含半胱氨酸的抗菌多肽，2001年Park等［5］首次从人尿中分离到这一多肽，并将其命名为铁调素。这种循环抗菌肽物质，在铁的动态平衡中发挥有效作用，作为激素样物质调节铁旁路途径的吸收、利用、贮存和再利用(肝脏和巨噬细胞) ［6,7］。本实验将两者结合起来，以骨质疏松为研究平台,旨在了解本实验研究模型基础上血清hepcidin 在“骨质疏松”形成中的变化情况。
1 资料与方法
1．1 实验动物 由苏州大学医学院动物实验中心提供。纯系SD雄性大鼠，72只，3月龄，体重（220±20）g；实验分组：模型组45只，对照组27只。
1.2 模型制作 大鼠饲养条件相同,喂以大鼠标准饲料和水。模型组鼠：蒸馏水溶解的维甲酸悬液，浓度7mg/ ml，以70mg/kg灌胃，每天1次，连续14天；对照组鼠：等量蒸馏水灌胃，连续14天。
1.2.1 实验处理 在灌胃处理后模型组鼠第1、3、5、7、8、9、11、12、14天处死（每次5只）和对照组鼠分别于相对应天处死（每次3只）。研究选择时间点是根据已有的初步研究结果［8］。
1.2.2 处死方法 采用3.6%水合氯醛腹腔麻醉，心脏取血，血清-20℃条件下保存，用于ELISA检测。
1.3 大鼠活体骨密度测定 仪器：骨密度测定DXA骨密度仪，Lunar公司，小动物扫描软件；条件设定为：步距0.5 mm ×0.5 mm ,扫描速度10mm/ s ,通过双能X射线骨密度测定仪测定正常对照组和模型组的骨密度，分析股骨、胫骨、腰椎骨选取感兴趣区域骨密度值。
1.4 血清hepcidin测定方法 按照ELISA试剂盒操作，试剂盒：Hepcidin Prohormone ELISA,96 well, DRG instruments GmbH, Germany（r=0.997）。
1.5 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件，所有数据用均数加减标准差（x±s）表示，两组间进行t检验，P<0.05差异显著性。
2 结果
2.1 骨密度 灌胃前后，对照组、模型组活体大鼠椎体、胫骨干和股骨干、股骨髁骨密度，模型组骨密度值明显降低(见表1)。表1 模型组、对照组各部位实验前后骨密度
2.2 血清铁调素含量 模型组和对照组比较，模型组的hepcidin含量第3、5、7、8、9、11、12天低于对照组，差异有显著性；而第1天和第14天含量也较对照组低，但没有明显差异；对照组hepcidin选取天的含量变化无明显差异性（见图1、表2）。图1 模型组和对照组血清hepcidin含量表2 模型组和对照组血清hepcidin含量
对照组hepcidin选取天的含量变化无明显差异性，呈现水平波动改变；和对照组比较，模型的hepcidin含量第1、3、5、7、8、9、11、12、14天都低于对照组，整体呈现初期降低，中期最低，后期略回升改变。
3 讨论
骨质疏松动物模型主要有维甲酸灌胃法、去势法和糖皮质激素注射法三种造模方式,其中维甲酸诱导观察周期稳定、成功率高和骨质疏松表现典型，本研究选用维甲酸灌胃法制作模型［9］ 。本研究骨密度测定结果显示模型组的骨密度较对照组明显降低，差异有显著性，证实了模型建立成功，与以往的研究符合。
体内铁贮存、铁代谢与骨质矿化和Ca2+有着密切的联系，一系列的研究表明铁动态平衡变化将影响骨代谢。Spanner 等人的研究结果认为铁蛋白（维持铁生物利用度的金属结合蛋白）在体和体外成骨细胞系的细胞上表达，调节着骨细胞胞内铁的转运，从而影响骨内金属离子的动态平衡［10］。2003年Ci等［11］研究显示，在K562细胞中，细胞铁摄入很大程度受到胞内钙离子浓度的调节，胞内游离钙离子升高会加速铁摄入的初始效率、全面提高细胞铁摄入能力。因此，铁代谢与Ca2+变化的关系，不仅越来越相关，而且越来越明确。
另一方面，关于铁代谢调节在2000年有了突破性进展。2000 年,Krause 等［12］首先从人血液中分离纯化了这一多肽,称之为肝脏表达的抗菌多肽(liver-expressed antimicrobial peptide ,L EAP-1)，2001 年Park 等［5］从人尿中分离到这一多肽,并将其命名为hepcidin。Hepcidin这种多肽调节铁吸收、利用、贮存和再利用(肝脏和巨噬细胞)［6,7］。Fleming、Chang等分别在2001、2002、2003年发表文章，认为铁代谢中影响骨细胞对钙吸收的重要分子可能是hepcidin（铁调素）［6，13,14］。Nicolas 等［15］证实铁沉积的发生与USF2无关,是hepcidin 缺乏导致小鼠进行性组织铁积聚,而且发现hepcidin 高表达的转基因鼠出现严重的铁缺乏,呈现严重的小细胞性贫血且生存时间大为缩短。Pigeon 等［16］证实,饮食铁含量增高或者肝铁增加均可导致肝脏hepcidin 表达增加。所有这些结果均证实hepcidin 在机体铁代谢调节中具有重要作用。
本研究显示：大鼠骨质疏松模型组，血清hepcidin含量在模型建立过程的第3、5、7、8、9、11、12天含量显著降低，而对照组没有这样的改变趋势。动物实验出现hepcidin含量降低变化，可能的解释：（1）在骨质疏松形成过程中，hepcidin体内存在变化，而已有研究说明，铁调素变化与铁代谢有关，铁代谢与钙代谢有关，本研究符合这一观点。（2）由于是在骨质疏松模型形成的中期，铁调素改变，这就有两种假设。 ①骨质疏松模型的诱因（维甲酸）刺激体内铁调素变化，而铁调素变化影响铁变化，铁变化又影响钙变化；②骨质疏松形成中，钙变化影响铁的变化，铁变化又引起铁调素变化。（3）由于影响血清hepcidin变化的因素也有可能在骨质疏松形成中出现变化，故其他因素变化（炎症因子等）也可而引起hepcidin的变化。（4）由于维甲酸作为一种白血病治疗的诱导药物，对血液各系细胞有影响，而血液各系细胞的变化可能引起hepcidin的变化。总之，本研究认为在骨质疏松形成诸多因素中，铁调素是一个参与因素。
本研究的结果为干预铁调素影响骨代谢平衡提出了新的研究平台，为进一步研究骨质疏松提供新的思路。随着铁调素已开始进行人工合成研究，已有学者正致力于将铁调素商品化。在骨质疏松研究领域，观察、研究“铁代谢调节因素（铁调素）”在“骨代谢异常（骨质疏松）”过程中的作用，对于骨质疏松症的机理、治疗、转归评定将有着十分积极的临床意义。所以，及早、全面了解铁调素对骨组织代谢异常的影响，将对骨质疏松诊断、治疗等方面提供新的干预方法研究有着十分重要的现实意义。
【参考文献】
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3 Denis M. Medeiros, Aaron Plattner, Dianne Jennings, et al. Bone Morphology, Strength and Density Are Compromised in Iron-Deficient Rats and Exacerbated by Calcium Restriction. J Nutr，2002， 132:3135-3141.
4 Margaret M. Harris, Linda B. Houtkooper, Vanessa A. Stanford, et al. Dietary Iron Is Associated with Bone Mineral Density in Healthy Postmenopausal Women. Nutr，2003，133:3598-3602.
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作者单位：215004 江苏苏州，苏州大学附属第二医院（Δ通讯作者）