大肠菌群快检纸片法在现场中的应用

【摘要】  目的 了解大肠菌群快检纸片法在现场中的应用情况。方法 根据快检纸片说明要求对待检样品进行测试分析。结果 菌量的多少对结果判定有一定的影响，粘贴法和涂抹擦拭法对结果无明显的影响。结论 只有掌握了实验各环节的诸多因素，才能综合判定出所测结果。

【关键词】  大肠菌群；快检纸片；分析

    大肠菌群主要来源于人与动物的肠道，是食品及水受污染的主要细菌卫生学指标。目前在检测方法上大多数的待检样品依然采用传统的发酵法，由于该法可适用于各类样品的检测，操作较为繁琐复杂，且时间长，耗费大。而大肠菌群快速检测纸片法（以下简称快检法）除了具有与发酵法相同的特异性及敏感性外，还具有经济、简便、快速等特点。已在各地推广并使用，签于快检法采样的局限性，近年来我们仅对本市、区的餐（饮）具消毒质量进行了监督检测，在全程检测中我们对结果的判断和可能出现的疑问以及与试验操作方法的吻合性进行了对比后发现了一些问题，有了一些思索，结合现场应用实践和基层提出的问题，我们提出以下想法仅供同行借鉴。

    1  快检法在颜色判定上存在的问题

    从原理上说，大肠菌群的细菌都是发酵乳糖的，快检法是将一定量的乳糖、指示剂（溴甲酚紫和TTC）以及营养成分等吸附于一定面积的无菌滤纸上，当细菌生长繁殖时，发酵乳糖产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由蓝色变黄色，此时产酸后的检样在纸片上呈现出黄色反应，同时含有的脱氢酶在适宜的pH范围内，可将相应的作用物脱氢，脱下的 氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲替。即又可在产酸后的黄色背景前提下显示出红色斑点（或红晕）。这一特点是快检法的典型特性。许多同行也以此特性作为阳性结果的唯一判断依据。但在实际检测中由于检样的不同以及许多不固定因素，在颜色的梯度上会出现一些难以判断的不定结果，我们具体归纳以下几点。

    1.1  不发酵乳糖细菌对颜色的反应  由于肠杆菌科有许多不发酵乳糖的其他细菌，此时如果无菌滤纸上吸附有一定面积养分并稍具备适宜细菌生长繁殖要求的营养成分，这类不发酵乳糖的菌就会在该纸片上以菌落生长形式呈现出红色斑点特征。由于此类菌不发酵乳糖，周围也就不会变黄色反应。又因为大肠菌群都是一类发酵乳糖的细菌。所以此时应考虑为大肠菌群以外的肠道菌，而不能误认为大肠菌群的细菌而定假阳性。由于大肠菌群的限定，该结果应列为阴性结果的范畴。

    1.2  菌量的多少对颜色的反应  在进行任何细菌检验时，菌量的多少一直都是个焦点问题，不可忽视。我们认为在快检法中，菌量多少与结果密切相关。当目的菌多时，大量的乳糖分解后使纸片产酸变黄色，同时使得酶的活性受到抑制，无法还原TTC，而不能形成红色斑点或红晕，此时的结果是纸片变黄。同样如菌量适中时，乳糖分解产酸整个纸片变黄色后，酶活性经过氧化还原反应后又形成红色斑点，此时纸片上在黄色背景下显示出的红色斑点（或红晕）即为典型的阳性结果。当菌量较少时，纸片上的每个菌落可形成一个红色小斑点，而且周围变黄色，显示出色彩鲜明的典型阳性结果。但如果所试样品纸片变黄色而无红色斑点（或红晕）时，应考虑是否菌量多而抑制了斑点的形成，严格地说这种结果也应直接判为阳性。必要时可以补加发酵法做证实试验，以避免误判。

    1.3  培养时间对颜色的反应  国家标准规定，采样后的快检纸片，应放置(37±1)℃培养16～18h后观察结果。如培养时间过长，生化反应不同的细菌因分解蛋白胨产碱，可使纸片由黄色变为灰褐色（V-P阳性菌），影响结果判定。我们在工作中将检样纸片在限定时间内进行观察后继续放置至24h观察，未发现有明显的变化。因此在结果判定上培养时间虽不是绝对而言，但为了控制V-P阳性菌的结果，时间最好限定在同一个范围内。以避免误判。有人建议新鲜食品或未经加工处理的食品(36±1)℃培养18～20h，冷冻、干燥或含有防腐剂的食品应培养20～24h为宜。但在高温季节应将采样后放置时间和路径的时间计算在内。以减少误差。

    1.4  操作方法对颜色的反应  大肠菌群纸片法现场快速检测时，方法虽简单，但对基层的同行来说存在一些误区，我们在现场对食（饮）具用纸片粘贴和涂抹擦拭后进行培养，以区别因工作人员的操作不一造成的误判，进行比较后发现，只要是阳性的检样，无论是两种方法中的哪种，均可出现同一种阳性结果。所不同的是阳性的程度差异而已。在定性上无明显区别。

    2  保存条件对快检纸片的影响

    为了避免操作中造成的误差，在实际工作中应对结果的判定和理解以及纸片保存等各方面进行全面掌握，由于纸片受贮存环境和外界因素影响可引起变质，正确的保存方法对确保其质量至关重要。最好将快检纸片放置在温度<20℃环境下保存，≤10℃的环境保存最宜，干燥、避光、通风更有利于快检纸片pH值的稳定。以上环境下保存可持续使用2年。酸碱物质可直接影响快检纸片pH值的测定，因此严禁与酸碱物质同放一处。如在未检前变黄色即为失效，不可再用。我们在现场进行检测时常选用的快检纸片规格为5cm×5cm，每次试验用2张，共50cm2 。主要用于物体表面大肠菌群的检测。对快检纸片的外观也应进行观察，内包装以及色泽等感观指标也应绝对符合质控要求。

    3  结果判定及分析

    综合以上检测我们认为任何一种试验都有它的综合因素，我们只有考虑了众多因素并控制了该因素后，才有可能完成它，因此我们对快检法的应用和结果判定上归纳总结以下几点提供于基层参考应用。

    3.1  阳性结果  （1）纸片上呈现红色斑点（或红晕），而且其周围均变为黄色，此结果为典型的阳性结果。（2）纸片中某些部分变黄色，有或无红色斑点（或红晕）时，此结果也应判为阳性。

    3.2  阴性结果  (1)纸片整个保持原蓝紫色或蓝紫色加深，此结果应判为典型的阴性结果。(2)纸片保持蓝紫色，但其中出现红色斑点或红晕，而周围不变黄色，此结果也应判为阴性（此结果最易误判为阳性）。

    3.3  可疑待证实后出具的结果  (1)纸片在限定培养温度及时间内全变黄色（该界线要与采样后立即变黄色者区分），此结果也应判为可疑阳性。应按发酵法做证实试验，以避免误判。(2)纸片采样后立即变黄色者，说明检样呈酸性状态，不易用该纸片法进行监测。此情况易误判为阳性。可改用传统的发酵法完成。

    3.4  其他不定因素的结果分析  现场中采用平行样检验主要是为了预防试验中结果的准确性和漏检、漏判等试验误差。有时在结果判断时也可出现平行样纸片不相同的反应，大多数情况下结果还是相互吻合的，只是反应量多少而异，因为该检测标准不是一个估计值的标准，而是不可检出的指标，所以只要某一方阳性应倾向于该方或进一步发酵法完成。

    另外操作时也要注意水分的控制，水分过多致使菌细胞悬浮似液体培养状态，此时菌落的形成也不易完成。操作时应以整个纸片湿润而又不滴水为宜，不可放在水中长时浸泡。

    大肠菌群主要来源于人畜粪便，通过此项检测可以间接的说明样品是否被粪便污染，因此将它作为细菌卫生学常用的重要指标。目前大肠菌群检测在各类食品及卫生细菌学检验中均被列为必检项目，快检法在卫生细菌学检测中也被广泛应用［1～5］，作为食（饮）具卫生消毒效果大肠菌群检测的法定方法之一，并列入了国家标准GB14934-94［6，7］。1998年又将快检纸片法纳入公共场所卫生监测规范。为了促进我国大肠菌群检测纸片质量的标准化，许多学者对此进行过质量标准研究。对纸片快速检测法予以充分研究［8］。综合我们对试验原理分析和结果判定，我们认为，一种好的试验方法，只有共同完善，取之长处，才有发挥前景，在此我们将粗浅的认识和微薄感想提供于同行，希望能得到认可，不足之处愿与共勉。

【参考文献】
  1 林奕华.1996～1997年食具卫生质量调查.中国卫生检验杂志,1999，9（4）：290.

2 肖绍昌. 临夏地区餐（饮）具消毒质量与对策.职业与健康,1999，15（8）：27.

3 刘世强.清流县城区餐具消毒质量调查分析.职业与健康,1999，15（8）：27.

4 邢业兰.食品用TTC纸片测定饮用水大肠菌群初探.中国卫生检验杂志,1998，8（5）：291.

5 朱忆.大肠菌群快速纸片法检测酱肉的结果评价与分析.中国检验杂志,1998，8（5）：305.

6 国家技术监督局.食（饮）具消毒方法.中华人民共和国GB14934-94.

7 孟昭赫.食品卫生检验方法注解.北京：人民卫生出版社,1990，48-82.

8 任泽萍,段发愚,李京,等.大肠菌群检测纸片质量标准研究.中国卫生检验杂志,2000,10(1):28.

作者单位：830011 新疆乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区疾病控制中心