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【摘要】 目的 研究DOC-1R基因转染对小鼠腹水瘤细胞体外生长的作用。方法 以pcDNA3-DOC-1R重组质粒转染小鼠腹水瘤细胞为试验组，同时以空载体pcDNA3转染为阴性对照组，以非转染组为空白对照，通过四氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 MMT结果示pcDNA3-DOC-1R转染组活细胞数较对照组明显减少，试验组细胞生长抑制率与前空白对照和阴性对照组比较分别是47.5%和45.0%，P<0.01；流式细胞检测结果显示试验组细胞凋亡数则明显增多，P<0.05。结论 DOC-1R基因转染可抑制小鼠腹水瘤细胞体外生长并诱导其凋亡的发生。
【关键词】 Doc-IR基因 腹水瘤细胞S-180 凋亡 小鼠
DOC-1(Deleted in Oral Cancer -1)是于1995年利用差减杂交法在仓鼠的口腔肿瘤模型中克隆的肿瘤抑制相关基因［1］。进一步研究表明此基因与CDK2的关系密切，其功能与DNA的复制和细胞周期相关［2］。随后，与其相关的又一肿瘤抑制相关基因DOC-1R(DOC-1 related)被克隆，并经实验证明其功能也与CDK2相关，是一种细胞周期抑制因子［3］。然而，目前对DOC-1R基因的功能研究尚少。本研究应用基因转染的方法将小鼠DOC-1R基因转染小鼠腹水瘤细胞中，以观察此基因对小鼠腹水瘤细胞体外生长的影响。
1 材料与方法
1．1 质粒和主要试剂 小鼠pcDNA3-DOC-1R重组质粒的构建［4］，RT-PCR试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine Plus脂质体转染试剂盒购自Life Technologies公司。
1．2 细胞培养 小鼠腹水瘤细胞S-180购自中科院上海细胞生物所细胞库，用含灭活10%小牛血清的培养液RPMI - 1640，在5% CO2、37℃饱和湿度下培养。
1．3 基因转染 取对数生长期的细胞, 接种于12孔培养板, 每孔1×106, 培养24h后, 用无血清的培养基洗涤2次以备转染。试验分组: 以转染重组质粒pcDNA3-DOC-1R为试验组,转染质粒pcDNA3为阴性对照组,未转染为空白对照组。按Lipofectamine Plus脂质体转染试剂盒说明方法进行转染。并经RT-PCR方法鉴定试验组细胞中有DOC-1R基因的表达。DOC-1R基因PCR扩增的上下游引物分别为:P1, 5’-CCgCTCgAgCgTgCgggCATTgCgTTCTgTCTC-3’；P2, 5’-gAAgATCTTggggATgTCCTACAAACCTATCgC-3’。
1．4 四氮唑蓝快速比色(MTT)法测定细胞生长抑制率 将经筛选、扩大培养后的各组细胞分别以每孔1 ×104 个接种于96 孔板,每组6个复孔,培养72h后依常规方法行MTT 试验，测定各孔的吸光度值(A550nm)，计算各组的平均吸光度值(A550nm)。实验组的生长抑制率IR(%)=(1-实验组平均A550nm/对照组平均A550nm)×100%。
1．5 流式细胞仪检测 胰酶消化收获实验及对照组细胞 , PBS洗涤后，再悬浮在冰冷的反应缓冲液中，细胞浓度为1 ×104个/ml 。取100μl 细胞悬液,加入5μl FITC-Annexin V、10μl PI (50mg/ L) 室温避光反应25 min 后，加入反应缓冲液400μl ,流式细胞术( FCM) 方法对凋亡细胞进行定量检测。
1．6 统计学分析 试验数据以SPSS10. 0 软件包行统计处理。
2 结果
2.1 MTT测定结果 各组分别测定550nm 波长平均吸光度，吸光度值分别是: 空白对照组 1.254 ±0.152； 阴性对照组 1.198 ±0.146； 试验组 0. 659 ±0. 096，试验组活细胞数较其他二组均低(P<0.05)。试验组细胞生长抑制率与前二组比较分别是47.5%和45.0%，差异均有显著性，P<0.01。
2.2 流式细胞术检测结果 见表1。表1 FITC-PI 双染流式细胞术检测细 胞凋亡构成比注：UL：损伤细胞；UR：晚期凋亡和继发坏死细胞； LR ：早期凋亡细胞； LL ：活细胞与试验组比较*P＜0.05
3 讨论
DOC-1(Deleted in Oral Cancer -1)是近年来在口腔肿瘤中发现的抑癌基因，其基因产物与CDK2结合，抑制CDK2蛋白的入核转运，从而抑制CDK2与cyclin形成复合物，参与细胞周期的调控，被认为是一种CDK抑制剂(CKI)，即细胞周期的负调控因子。 DOC-1R (DOC -1 related)基因是随后通过酵母双杂交法发现的另一候选抑癌基因。已有的研究发现DOC-1 和 DOC-1R蛋白都能结合DNA聚合酶α/解旋酶，从而抑制DNA的复制过程。
我们在前期的研究中已经克隆了小鼠的DOC-1R基因序列，小鼠的DOC-1R基因开放阅读框架(ORF)共有381个碱基，编码127个氨基酸。同时我们还构建了小鼠的DOC-1R基因正义和反义的表达载体，初步的研究也发现DOC-1R基因能够抑制小鼠NIH3T3细胞的生长［5］。然而关于此基因的更深入的功能研究目前比较少。本研究中，我们通过基因转染的方法将DOC-1R基因导入小鼠腹水瘤细胞中，发现转染了pcDNA3-DOC-1R重组质粒的小鼠腹水瘤细胞在体外的生长明显受到抑制，经MMT法测定细胞的生长抑制率与非转染组和转染空载体组比较均有明显差异，同时试验组凋亡的细胞数量也明显增多。研究结果表明，DOC-1R基因能够抑制小鼠腹水瘤细胞的体外生长并能够诱导细胞的凋亡。然而关于DOC-1R基因抑制细胞生长和诱导凋亡的具体机制和途径尚有待于今后的进一步深入研究。
【参考文献】
1 Todd R,Mebride j,Tsuji T,et al. Delated in oral cancer-1(doc-1),a novel oral tumor suppressor gene. FASEB J,1995,9(13)1362-1370.
2 Tsuji T,Duh FM,Latif F,et al. Cloning,mapping,expression,function,and mutation analyses of the human ortholog of the hamster putative tumor suppressor gene Doc-1.J Biol chem.,1998,273(12):6704-6709.
3 Zhang X,Tsao H,Tsuji T,et al. Identification and mutation analysis of DOC-1R,a DOC-1 growth suppressor-related gene. Biochem Biophys res Commun,1999,255:59-63.
4 周伟强,姜莉,生秀杰,等. 小鼠DOC-1R基因反义重组载体的构建及表达的研究. 癌症,2002,21(3):240-244.
5 生秀杰,周伟强,姜莉,等.小鼠DOC-1R基因的克隆及表达. 癌症,2002,21(2):122-126.
作者单位：510150 广东广州，广州医学院第三附属医院妇产科研究所