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【摘要】 近年来，胶质瘤的基因治疗研究发展迅速，现已出现多种治疗方案，有些已应用于临床，取得了一定的效果，但也存在着许多有待解决的问题。针对肿瘤发生的复杂性和多样性，将几种治疗方案进行有效联合以提高疗效是目前工作的新热点，本文对近年国内外联合基 因治疗的几个方面作一简要综述。
【关键词】 胶质瘤;基因治疗;联合治疗
随着影像学、血管内介入和显微神经外科等诸多重要技术的革命性进步，颅内良性肿瘤的预后已有了一定程度的改善，但占颅内肿瘤达半数的恶性肿瘤的疗效却无明显变化，因此一些科学家在传统的手术+放化疗的模式之外，进行了基因治疗的探索。
近10年来，人们在胶质瘤的基因治疗方面进行了大量的动物实验研究，以期探讨基因治疗对胶质瘤的治疗作用，目前世界上已有200多项基因治疗临床研究项目正在进行中，然而总体治疗效果并不十分令人满意，尤其是临床应用方面，其中原因之一就是有效目的基因的选择问题。
众所周知，肿瘤是一种多基因病变，并非由单一基因所引发，故单一基因的治疗效果必将有限。因此，许多学者建议选择具有协同或互补作用的多基因联合应用，可能会提高抗肿瘤的效果。
顾名思义，肿瘤的联合基因治疗就是联合应用几种不同目的基因以求获得更佳的抗肿瘤效果，进行优势互补，以确实提高疗效 ，并为进一步深入探讨抗肿瘤效应的分子机制提供基础。目前，一些研究已经表明,多基因的协同配合优于单基因的抗肿瘤效果，联合基因治疗将极大地提高肿瘤基因治疗的效果［1,2］，本文就目前国际上比较公认的几种联合基因治疗方法作一综述。
1 联合基因治疗的主要研究热点
1.1 免疫因子基因治疗的联合应用 免疫基因治疗是目前开展最多的一种基因治疗，它的原理是将细胞因子基因转导入肿瘤细胞中，从而激发机体产生抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。免疫因子基因的应用已成为肿瘤生物治疗的重要内容，其中细胞因子基因的应用不但可通过激活免疫细胞，诱生细胞因子来调节增强机体固有的免疫功能和抗肿瘤能力，还具有一定程度的直接抑制肿瘤的效应，其疗效已在许多动物和人体实验中得到证实［3］。目前常用的细胞因子有IL-2、IL-4、IL-6等，其中lL2和 GM-CSF被认为最为有效［4］。
Yamada M等［5］将GM-CSF基因和IL-4基因共转导B16细胞,灭活后的瘤苗接种于小鼠胶质瘤模型中发现，两种基因共转导瘤苗比GM-CSF基因瘤苗诱导更强的抗肿瘤免疫。由于IL-4瘤苗在脑内和皮下模型中不能诱导明显的抗瘤免疫,因此可能是局部产生的IL-4补充了GM-CSF的生物活性，进一步研究表明,IL-4能进一步增强GM-CSF激活的抗原提呈过程,从而促进CD+4T、CD+8T和asialoGM+1细胞的激活；Sun等［6］用基因枪将含IFN-γ基因的质粒和含IL-2基因的质粒同时打入小鼠胶质瘤体内后,荷瘤鼠的生存期显著延长,经过治疗的25%的小鼠超过60天未致瘤,比转染单一基因具有更好的抑瘤效果。
研究表明［7］，机体免疫系统对肿瘤的特异杀伤作用主要依赖于细胞免疫，共刺激分子B7与T细胞受体CD28的相互作用是T细胞激活所必需的。动物实验也已证实转导 B7基因瘤苗可必降低致瘤性，诱导保护性免疫，可与一些增强肿瘤细胞免疫原性的基因联合应用。 Cayeux［8］等将B7基因和IL-7基因导入TS/A(H-2d)和MCA205(H-2b)肿瘤细胞中发现B7基因、IL-7基因单独表达时可使肿瘤细胞致瘤性降低，但能在部分小鼠体内成瘤。相反，两者共表达的瘤细胞则完全失去致瘤性，没有小鼠长瘤，说明B7基因和IL-7基因联合转导癌细胞能诱导更强的抗瘤免疫，从而抑制肿瘤的生长。
2 以反义基因为主导的联合基因治疗
2001年以来出现以端粒酶催化亚基 hTERT(human telomerase reverse transcriptase)基因启动子为主的联合基因治疗方案来治疗肿瘤，主要利用hTERT启动子能严格控制其下游目的基因在hTERT阳性细胞中表达［9］。Komata等［10］用hTERT基因和Caspase-6基因联合；Majumdar等［11］用hTERT和TK基因联合，都取得了令人较为满意的实验室结果。
尤永平等［12］发现，利用反义hTERT和PTEN在体外试验中单独或联合转染两种基因都能明显抑制肿瘤细胞的生长，以联合转染效果最明显，转染后第6天联合转染组的细胞生存率为37.6％，端粒酶活性水平和 hTERT蛋白表达水平明显下降，分别为28.8TPG、0.2106，PTEN蛋白表达水平上升为0.9630；在体内试验中肿瘤生长也明显减慢，从而认为腺病毒介导的反义hTERT和野生型PTEN联合转染能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长。其机制为胶质瘤细胞共转染两种目的基因后，可以从不同的途径影响肿瘤细胞地生长，协同抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进展，细胞较多地聚集在G0／G1期、抑制肿瘤细胞的粘连和迁移等，达到治疗恶性胶质瘤的目的。
国内学者［13］在胶质瘤基因治疗的动物实验中采用了PTEN-反义AKT2的联合基因治疗策略，进行了大鼠C6胶质瘤细胞系的体内和体外实验研究，应用共转染后，两者可以产生协同作用，共同抑制肿瘤细胞的生长、诱导细胞的凋亡、阻滞细胞周期的进展等。从理论上可知，由于PTEN是一种以PIP3为主要底物的磷酸酶，其主要功能为对PIP3进行3位脱磷酸，由于PIP3可以和AKT的AH/PH结构域结合并与细胞膜锚着，并作为AKT辅助因子PDK1的变构激活剂启动AKT的激活过程，从而激活PI3K-AKT2信号传导通路下游的一系列靶分子，使细胞产生癌变，所以，PTEN可以成为拮抗PI3K、下调AKT/PKB通路的重要调节基因。实验结果也证实了这一点：通过两种基因的共同转染C6胶质瘤细胞，无论在体内还是体外实验中都取得了比单采用PTEN或反义AKT基因治疗更好的效果，说明恶性肿瘤的联合基因治疗是充分利用多种目的基因所发挥的不同抗肿瘤效应，进行优势互补，确实可以提高疗效，并且为进一步深入探讨抗肿瘤效应的分子机制提供了基础。
1.3 以自杀基因治疗为主的联合基因疗法 在肿瘤基因治疗中，自杀基因的作用十分引人注目，尤其是旁杀伤效应的存在大大增强了其治疗作用。
Yamaguchi等［14］最新发现了Bcl-2家族中细胞凋亡激活因子BH3中的一员BimS，由于它所诱导的细胞凋亡通路与HSV-TK／GCV基因疗法的通路不同，他们用腺病毒载体(adenovirus vector，AVC2)将 BimS和TK联合转染 U251等4类恶性胶质瘤细胞株，发现AVC2一BimS可提高瘤细胞对GCV的敏感性，特别是在U251细胞株中，无论是体内还是体外实验都证实，该疗法可增加 HSV-TK/GCV治疗的细胞毒性，使死亡瘤细胞数量明显上升，提高了 HSV-TK／GCV杀瘤效果。
Niranjan等［15］以高度缺陷型单纯疱疹病毒为载体，尝试在编码 TK基因的基础上合并肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因联合治疗胶质瘤。经过对荷胶质母细胞瘤的裸鼠模型进行体内转染并辅以放疗，发现HSV-TK／GCV合并TNF-α联合疗法最为有效，小鼠的75天存活率明显高于对照组,可见联合HSV-TK／GCV与TNF-α治疗胶质瘤具有协同效应。
Rogulski等［16］用能表达CD/HSV-TK融合蛋白的9L脑胶质瘤细胞接种裸鼠,结果显示:联合基因对肿瘤的抑制作用明显高于两种基因的单独作用，3个月动物成活率达40％，且停药后肿瘤复发率低，对已形成较大体积肿瘤的治疗疗效更为理想，这一结果对晚期肿瘤具有重要意义。
Kim等［17］利用腺病毒载体(adenoviral vector，Ad)Ad-P53与Ad-P16将P53、P16或二者同时转染胶质瘤细胞株U87MG和U373MG中，结果显示，P53与 P16共表达的情况下,两类细胞株中都显示出较强的抑癌作用，而且这种作用比在同等条件下的单基因治疗作用要强，说明P53与P16的联合治疗具有协同效应。
1.4 自杀基因与免疫基因之间的联合应用 自杀基因治疗和免疫基因治疗是至今进展最显著的两种肿瘤基因治疗方法。近年来的研究发现，自杀基因的作用与机体的免疫功能有密切关系，正常免疫功能的机体可增强旁杀伤效应，而自杀基因的作用又可刺激机体免疫功能，发挥远处的旁杀伤效应，自杀基因治疗与免疫基因治疗有协同作用。
Takeda等［18］在结肠癌肝转移模型上直接瘤体内注射含mlL-2基因和HSV-TK基因的重组腺病毒后发现，单用TK基因或与mlL-2基因联合均有明显的肿瘤坏死和消退，但只有联合应用时才诱导抗亲本肿瘤的免疫力，此免疫力与肿瘤细胞特异性CD+8T细胞的存在有关。另有一些学者的实验也证实了这一论点，证实了二者联合应用的抑瘤效果更强，并且未发现对邻近组织和远处器官产生细胞毒性。
陈诗书等［19］应用TK基因修饰的肿瘤细胞分别与IL-2、TNF-a及 IL-12基因修饰肿瘤细胞进行协同配合抗肿瘤研究。结果表明，双基因协同配合具有显著的抑制肿瘤生长的作用，尤以TK与IL-2或IL-12间的协同配合更为有效。
1.5 封闭癌相关基因的联合基因治疗 Adachi等［20］研究发现，尿激酶型纤溶酶原激动子受体(urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)和肿瘤抑制因子P16在胶质瘤的侵袭性方面扮演重要角色。他们利用反义技术封闭 uPAR的表达，同时使P16基因高表达，利用腺病毒载体构成了Ad-uPAR／P16双顺反子载体，转染后通过细胞周期分析显示，联合基因治疗使瘤细胞停留在G0／G1期，较对照组明显抑制了瘤细胞的生长和侵袭性，取得了满意的效果，说明以uPAR和P16为靶点进行联合基因治疗具有一定的可行性。
国外一些研究人员发现［21］，由于P53在细胞增殖和细胞凋亡两方面具有双重调节作用，因此最早成为肿瘤基因治疗的候选基因，但P53的导入并不是在所有的肿瘤中均能有效诱导凋亡，尤其是Rb表达阳性的肿瘤细胞，因为Rb同时具有抑制凋亡的作用。研究人员将P53和P16两种基因同时导入肿瘤细胞，由于P16的表达可抑制Rb蛋白的合成，提高了肿瘤细胞对凋亡的敏感性，其协同效应加强了对肿瘤细胞的抑制作用［22］。
2 联合基因治疗存在的问题
但是，并不是所有的基因共转染均能产生协同作用。例如，为探讨P16基因和P21基因是否具有同样的联合效应，Mobley等［23］将P16和P21联合转染体外培养的肿瘤细胞，发现对生长的抑制作用与单纯应用P16和P21相比较无明显增强效应；流式细胞仪分析结果显示,三者G0/G1期阻滞的细胞数差异无显著性,体内实验联合基因组未出现协同抑制作用，表明选择具有协同作用的联合基因治疗的靶基因也是至关重要的，必须进一步深入研究。
以往的研究多认为，HSV-TK与 CD双自杀基因联合治疗胶质瘤有效，但最近 Moriuchi等［24］对HSV-TK+CD联合基因治疗胶质瘤的研究显示，这两种自杀基因的联合疗法并不比单基因疗法的效果好。他们以复制缺陷型病毒为载体，对比了联合或单独表达这两种基因的方法，在体内或体外对9L胶质瘤细胞进行转染。发现在同等条件下，单独采用其中任一种自杀基因疗法要比联合基因治疗的效果好。由此可见，HSV-TK与CD双自杀基因联合治疗的疗效并不肯定，甚至这两种基因在治疗中作用可能是相互拮抗的。
3 联合基因治疗的前景与展望
恶性胶质瘤的发生与发展是多基因联合作用的过程，因而在基因治疗胶质瘤方面，将相互间有协同效应的不同基因治疗方法联合起来，充分利用各种细胞因子之间的优势，同时弥补各自的不足之处，无疑可以提高治疗的有效性，从而弥补以往单基因治疗的诸多不足，不仅能极大地提高肿瘤基因治疗的效果，减少单独使用时的副作用，而且有利于深入探讨抗肿瘤作用的效应机制。
联合基因治疗策略的不断优化依赖于多方面的进展，如继续寻找和获取治疗效果显著的抑癌基因、组织特异性和可控性基因表达载体的构建、给药途径的完善等，寻找目的基因的最佳协同配伍是其核心内容之一。研究不同目的基因之间两两配合所发挥的抗肿瘤效应，通过可靠的统计学分析比较，寻找最佳协同配伍，才能取得最佳的治疗效果。
总之,肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，单一基因的纠正往往不能达到理想的抑制肿瘤效应，作为一种新的治疗方法，联合基因治疗已经初步显示出广阔的应用前景。因此，进一步研究肿瘤发生发展的机制，提出新的治疗方案或将现有途径进行有效联合，是基因治疗研究的热点, 联合基因治疗是基因治疗发展的必然趋势，相信通过基因之间或与其它常规治疗方法之间的合理的联合应用，将找到更佳的肿瘤治疗新模式，为胶质瘤患者带来福音。
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(编辑：宋 冰)
作者单位：1 300060 天津，天津环湖医院神经外科 2 天津，天津医科大学总医院神经外科