点击显示 收起
【摘要】 目的 观察不同影响因素（贮存时间和温度、冻融次数）对SELDI-TOF-MS检测羊水的影响。方法 收集羊水后进行蛋白定量，利用SELDI-TOF-MS检测不同条件（贮存时间和温度、冻融次数）下羊水。结果 羊水在25℃和4℃贮存3天蛋白峰强度下降，冻融第5次时蛋白峰强度下降甚至消失。结论 利用SELDI-TOF-MS进行羊水标志物检测时应当考虑外源性因素的影响。
【关键词】 SELDI-TOF-MS；羊水
羊水是胎儿正常发育的基础，是反映胎儿生理、病理状况的潜在标志物来源［1］。表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱（Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）具有不同的芯片表面，能够捕获多种蛋白、耗时少、灵敏度高、高通量检测多种临床样本。Park等利用SELDI-TOF-MS分析慢性高血压和血压正常妊娠妇女羊水，检测到两个标志物：SBBI42(17399.11 Da) 和Proapolipoprotein A-I (28023.34Da)［2］。虽然目前已经利用SELDI-TOF-MS对不同的样本进行了大量研究，但是由于每个实验室条件、操作者技术熟练程度不同，从标本获取到检测过程中多种因素都会对实验结果造成影响，因此必须在检测过程进行严格的质量控制。Stefan Schaub等利用SELDI-TOF-MS对尿液检测，发现各种因素等都对检测结果造成很大影响［3］。这表明利用SELDI-TOF-MS检测不同体液样本时，存在多种影响因素，而且同样的因素对不同样本影响不同。基于此，我们研究羊水检测过程中两个主要的处理因素（冻融次数、放置时间和温度）对芯片检测结果的影响。
1 材料与方法
1.1 羊水收集
行羊膜穿刺术收集12例16～18周健康妊娠妇女，年龄26～39岁；羊水10ml，4℃ 1000×G离心10min，收集上清并-80℃冻存。
1.2 主要试剂和仪器 尿素、醋酸钠、TFA、乙氰、ACN、HEPES和CHCA均购自Sigma公司，PBSⅡ-c质谱仪及WCX2蛋白质芯片购于美国Ciphergen公司。蛋白定量试剂盒购自BioRad公司。
1.3 羊水预处理及上样
样本收集后分别于室温（25℃）和4℃放置1天和3天，观察不同放置时间和温度的影响。将标本等分（500μl/管）后分别冻融5次，观察冻融次数的影响。所有样本用SELDI-TOF-MS检测。
BCA定量羊水蛋白浓度为8～10mg/ml。取40μl（400μg）血清与50μl U9混匀，室温400rpm振荡，30min后加入WCX2芯片，室温400rpm震荡孵育1h。甩出样品后每孔加WCX-buffer 200μl，室温400rpm震荡5min，甩去孔中液体，重复一次。每孔加入200μl HEPES后立即甩出，立刻取出芯片，风干后每点加CHCA 0.5μl，重复一次，风干后上机检测。
1.4 数据收集及分析
NP20标准芯片校正质谱仪，激光强度170，灵敏度8，数据收集范围2～15KDa，CiphergProteinChip 3.2软件采集数据。设定流程信噪比为5、最小峰阈为10%，BiomarkerWizard software 3.2进行不同m/z峰强度的比较。
2 结果
2.1 贮存时间和温度对羊水蛋白峰检测的影响
羊水在25℃和4℃分别放置1天和3天后检测，与新鲜羊水（2h）检测结果进行比较。在25℃和4℃放置1天后，峰（m/z 3106.5, 4625.5, 5260.4）降低，在25℃和4℃放置3天后，许多峰强度开始降低（m/z 6428.7等），峰（m/z 6880.5等）消失（见图1）。因此贮存时间和温度对SELDI-TOF-MS检测蛋白峰有显著影响。
2.2 冻融次数对羊水蛋白峰检测的影响
冻融4次（-80℃）对检测结果无显著影响，冻融第5次后，一些峰强度减低甚至消失（见图2）。
3 讨论
利用高通量的蛋白质组学工具（如质谱）进行妊娠异常疾病的研究是当前的研究方向［4］。SELDI-TOF-MS由于具有快速、高通量、敏感性高等优点而广泛应用于临床研究中，体液样本（如尿液、血清、唾液、羊水、胸水等）收集、贮存、冻融次数的不同都会对峰的检测有重要影响。由于受到临床各种因素的限制，羊水可能放置一定的时间才能检测，本研究中我们发现当羊水放置1天后一些峰的强度降低，放置3天后则强度进一步降低，但是在放置3天后25℃和4℃检测到的峰无显著变化，因此贮存时间的影响要大于温度的影响。其可能的原因是羊水中的蛋白酶如fetal membrane proteases能够降解蛋白，因此我们建议收集羊水后应当在24h内检测。研究发现冻融次数对体液（如尿液等）检测有影响，我们也观察了冻融次数对羊水检测的影响。研究发现在冻融第5次时对峰检测有影响。因此我们建议羊水收集后应-80℃冻存，并避免反复冻融。
我们的研究结果显示SELDI-TOF-MS是一个高敏感性和重复性的蛋白质组学研究平台，我们首次分析了冻融次数、贮存时间和温度对羊水检测的影响，并建立了SELDI-TOF-MS检测羊水的标准流程。
【参考文献】
1 Michaels JE, Dasari S, Pereira L, et al.Comprehensive proteomic analysis of the human amniotic fluid proteome: gestational age-dependent changes. J Proteome Res，2007,6(4):1277-1285.
2 Park JS, Oh KJ, Norwitz ER,et al.Identification of proteomic biomarkers of preeclampsia in amniotic fluid using SELDI-TOF mass spectrometry. Reprod Sci,2008,15:457-468.
3 Schaub S, Wilkins J, Weiler T, et al. Urine protein profiling with surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Kidney Int，2004,65(1): 323-332.
4 Cadron I, Van Gorp T, Amant F, et al. The use of laser microdissection and SELDI-TOF MS in ovarian cancer tissue to identify protein profiles. Anticancer Res,2009,29(4):1039-1045.
作者单位：251500 山东临邑，临邑县人民医院输血科