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【摘要】 流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。每年流感的流行都会造成巨大的人力和物力损失。流感疫苗的接种依然是预防流感病毒感染的主要手段，本文主要针对流感的灭活疫苗、细胞培养疫苗及减毒活疫苗、DNA疫苗、表位基础疫苗、通用疫苗、人用禽流感疫苗的当前应用和研究状况及发展前景进行了简要综述。
【关键词】 流感疫苗;研究进展
1933年流感病毒首次被用于感染了实验动物雪貂，开始了人类对流感病毒的认知。数十年来，流感病毒的流行已给人类社会带来无法估量的损失。20世纪中流感的4次全球性大流行，其结果更是灾难性的。自1952年来每年WHO会依据流感病毒的变异规律推荐出的用于下一年度疫苗生产用流感病毒疫苗株。近年来禽流感病毒不断突破种属限制感染人类，令流感的流行情况变得更加复杂。
疫苗的使用依然是预防流感的有效手段，临床上主要应用的是用鸡胚生产的三价灭活疫苗。此外，亚单位疫苗，细胞培养疫苗，减毒疫苗也已经在一些国家中生产应用。最近，人用禽流感灭活疫苗获得了FDA的批准使用。但至今流感的防治仍是一个全球性的难题，各国的学者们仍在对新型流感疫苗进行探索。
1 灭活疫苗
1941年流感病毒灭活疫苗在美国首次被批准使用， 1945年在美国民众中开始广泛应用。全球各国长期的使用经历证实灭活流感疫苗是安全有效的。根据纯化工艺可将其分为全病毒疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。目前，使用的流感疫苗主要是经鸡胚培养的灭活三联裂解疫苗，成分包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒株。研究表明，通常使用流感灭活疫苗可在70%～90%青年人中诱导血清HA抗体产生，而仅可在30%～70%老年人中可诱导血清HA抗体[1]。
单独使用灭活疫苗，可能存在激发的细胞免疫水平低下，仅能对抗原相配病毒株产生免疫保护，无法有效在老年人中诱生高水平的抗体等缺陷。学者们开始尝试在流感灭活疫苗中添加各种不同类型的佐剂，如MF59、ODN、CAMPs、ISCOM、GM-CSF、IL-2等，佐剂的使用有效提高了灭活疫苗的免疫效力。MF59(唯一获准的人用佐剂)是目前正在应用的一种极具潜力的佐剂。其诱发的抗体水平可达未加佐剂组的1.5倍，同时该抗体具有较好的交叉保护性，对变异的同亚型流感毒株也可产生保护[2]。
2 细胞培养疫苗
以鸡胚为基质生产流感疫苗需要复杂的纯化过程以减少人们对鸡胚蛋白产生的变态反应;另外鸡胚难于大规模生产以满足流感大流行突发需求。因此，哺乳动物细胞系被应用于流感疫苗的生产，以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染，易于规模化生产，能较好的维持病毒抗原稳定等优点。 目前，用于流感疫苗生产的细胞系包括MDCK和Vero两种。
MDCK细胞系是最早获准应用于人流感疫苗的细胞系。Genzel Y采用微载体悬浮技术在无血清培养基中，培养MDCK收获了高滴度的流感病毒，无血清培养基的使用可以减少在病毒感染前需洗涤去除血清和更换培养基的过程[3]。Solvay公司使用MDCK生产的流感疫苗已经在荷兰上市。
Vero细胞系是一种生物制品标化的传代细胞系，并可用1200L的大型发酵罐进行培养，极大方便了疫苗的生产。大量的临床实验表明，Vero细胞试制的流感疫苗有较高的免疫原性，安全可靠。
3 减毒活疫苗
减毒活疫苗的使用模拟了病毒侵入机体的状况，可有效诱导细胞免疫、体液免疫、黏膜免疫的产生，免疫保护持久并广泛，与灭活疫苗相比能更好应对变异流感病毒的攻击。
美国和俄罗斯科研人员通过将流感病毒在鸡肾原代细胞和鸡胚中于25℃反复传代，获得了最早的冷适应“种子株”。大量临床实验证明，冷适应减毒流感疫苗具有很好的遗传稳定性，对成百上千万人群接种后，证实是安全有效的，而且冷适应减毒流感疫苗比灭活苗更适用于儿童。冷适应减毒流感疫苗在俄罗斯已进入临床应用，在美国2003年获得FDA批准。
通过对NS蛋白和M蛋白改造，可以获得理想的减毒株。通过截短流感病毒NS1片段，降低了NS1对IFN-r活性的抑制作用，获得的流感病毒在鸡胚和小鼠生长明显减弱，小鼠和猪在免疫后均获得了对野生型流感病毒的免疫保护。而缺陷流感NS2，所得到的复制缺陷株同样保护94%的小鼠抵抗病毒致死性攻击[4]。
4 DNA疫苗
核酸疫苗因能够同时刺激机体体液免疫和细胞免疫而倍受研究者的青睐，美国国立卫生研究院和世界卫生组织都强调核酸疫苗是流感疫苗的一个重要研究方向。DNA疫苗具有容易操作，稳定，安全的优点，快速易于构建的特点使DNA疫苗能更快应对流感病毒抗原变异的状况。
在诸多动物如小鼠、鸡、雪貂、猪等实验中，发现基于流感HA和NA的DNA疫苗主要通过诱生抗体来对机体产生免疫保护。单独采用HADNA疫苗通过基因枪或肌肉注射的方式免疫小鼠后，可产生高水平的抗HA抗体，抗体类型以IgG1为主，并能维持达1年半之久。通过黏膜免疫，则可在鼻黏液中检测出抗HA的分泌型IgA。HADNA疫苗产生的抗体可保护免疫动物较好抵御同源病毒的攻击，保护率达100%。而单独使用NADNA疫苗产生的保护作用较单独使用HADNA疫苗弱，但可对具有相同NA亚型，而不同HA亚型的病毒产生交叉保护。采用NP和MDNA可诱生的强烈CD8+CTL和CD4+Th细胞免疫反应，并在抵御病毒攻击中起到重要保护作用。NP和M基因的保守性，又决定了其DNA疫苗可产生更好的交叉保护能力。
由于自然状态下流行野毒株HA和NA常会发生变异，会致所构建的HA或NA DNA疫苗保护力下降，而NP和M基因虽保守，但单独使用时保护力又相对较差。研究者们常常采用两种或多种DNA疫苗联合免疫的策略。联合使用HA、NA，HA、NA和M1，HA和NP，NA、NA和NP的DNA疫苗均获得了良好的效果。Xie 等在pBudCE4.1载体不同启动子下表达HA和M1的DNA疫苗单独免疫，与同载体分别表达HA和M1的两种DNA联合免疫相比，具有更好的免疫保护作用，推断可能是DNA疫苗转染进入细胞后，在同一细胞内既表达了HA蛋白又表达了M1蛋白，模拟了自然状态下病毒侵入的情况，从而产生协同作用[5]。
5 表位为基础的疫苗
随着生物化学、分子免疫学及基因工程技术的发展，出现了以表位为基础开发的流感疫苗。表位疫苗可以通过选择正反应表位避免副反应表位，减少了疫苗毒副作用，提高了安全性，增强了免疫针对性。
目前，已鉴定出的来源于不同种属动物，如小鼠、人、鸡、山羊、雪貂、猕猴等，来源于不同毒株的流感各类表位600多条。Arnon等以HA91～108B细胞表位，NP55～69Th表位，NP147～158CTL表位为组分，于减毒沙门菌鞭毛蛋白中进行了表达，以纯化的鞭毛悬液免疫小鼠诱生了特异性的细胞和体液免疫，并保护小鼠抵抗致死和亚致死性病毒感染，所提供的保护达7个月。贾雷立等构建的复合多表位DNA疫苗和鸡痘病毒重组疫苗在免疫小鼠后，获得了高水平的针对表位的抗体，细胞免疫水平CD4+和CD8+T细胞水平显著升高[6]。而进一步研究发现，虽然某些表位能诱发强烈的CTL活性，却不能抵御病毒的攻击，Sherry R等发现表位HA332～340，M1128～135，PA224～233免疫小鼠后能诱导脾脏中表位特异性CD8+T细胞的增加，但在病毒攻击后却推迟了病毒的清除[7]。表位疫苗虽然具有很多优点，但表位发挥功能的机制及强弱，表位的基因限制性，表位与表位间协同作用等问题尚不完全清楚，甚至某些已鉴定的表位本身还存在争议，表位疫苗需要更深入的研究。
6 通用疫苗
流感抗原变化非常迅速，每年各大疫苗公司都要更新疫苗株，到准备好新的疫苗，其生产周期往往需要9个月，人群则需要每年进行免疫接种。如果某一流感大流行株出现，如H5N1禽流感变异株，在制备匹配疫苗的过程中，就可能已造成上百万人死亡。“通用流感疫苗”-一次接种即能在数年甚至一生的时间中抵抗各种亚型流感的攻击，即是其研发的初衷。
由于HA和NA属于流感病毒表面蛋白，变异性强。最近的研究普遍认为M2和NP是通用疫苗的开发的基础。尽管M2是一种较弱的抗原，但将其与合适的载体耦联如乙肝核心抗原，在小鼠实验中成功抵御了流感病毒的攻击[8]。通过脂质粒包裹纯化的M2e(M2胞外域)，可在H5、H1、H6、H9亚型流感之间产生交叉保护作用[9]。虽然迄今为止，还没有开发出一种针对人的通用流感疫苗产品，但M2和NP的研究在该领域是极具前景的。
7 人用禽流感疫苗
甲型 H1N1 流感疫情爆发以来，全球各国都关注疫苗的研发和生产。我国北京科兴于6月8日正式获得由美国CDC提供的甲型H1N1流感疫苗生产用毒株NYMC X-179A，当晚即启动了种子批制备工作，6月15日正式开始第一批疫苗的生产。
近几年， H5N1亚型禽流感病毒在家禽中流行，并不断造成人类感染及死亡。2007年4月美国FDA首次批准了法国Sanof pasteur公司以越南患者体内分离的A/Vietnam/1203/2004株禽流感病毒生产的灭活疫苗。葛兰素史克公司开发了含佐剂的H5N1灭活疫苗证实具有很好的交叉保护力。中国科兴公司开发的H5N1人用禽流感灭活疫苗已于2008年初完成二期临床。Holman DH等还进行了腺病毒载体细胞培养灭活疫苗的探索[10]。但目前所有针对H5N1亚型开发的人用禽流感疫苗仅仅是作为战略储备，只在可能发生H5N1大流行时由政府统一发放，并不会在市场上出售。
8 其他研究中疫苗
流感病毒样粒子疫苗―通过将流感表面抗原HA、NA、M1重构组装，缺失病毒的遗传物质，即形成了病毒样粒子，在机体免疫递呈中病毒样粒子可以模拟天然病毒的状态，从而增强机体免疫应答的水平。de Bruijn IA的研究显示，病毒样粒子疫苗可同时激活体液和细胞免疫，其所具有的免疫原性与佐剂添加疫苗相当[11]。相关产品Inflexal-V已经在瑞士和意大利使用。此外，Treanor JJ进行了重组杆状病毒表达HA的三价流感疫苗的研究[12]。众多先前的研究说明，采用重组DNA技术来开发泛保护性的流感疫苗是很具潜力的。
9 小结
从人类发现流感病毒至今已有75年的历史，但每年流感的防治依然是全球性关注的问题，每年流感高发季节，仍会造成巨大人力和物力的损失。在以使用灭活疫苗为主的大背景下，各大疫苗公司及研究单位纷纷进行着新型疫苗的探索。DNA重组技术、反向遗传技术的成熟，将流感疫苗的开发推入了一个新时期，以此构建与流行野毒匹配的疫苗株制作的灭活疫苗，减毒疫苗纷纷开始投入使用，并获得了良好的效果。随着人们对流感病毒本身认知的不断深入，更逐步形成了开发流感疫苗的新思路，在此指导下研究的新型表位疫苗、通用疫苗、病毒样粒子疫苗、DNA疫苗等纷纷涌现。相信不久的将来人类定会在与流感的抗争中获得最终的胜利。
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3 Genzel Y, Olmer RM, Schafer B, et al. Wave microcarrier cultivation of MDCK cells for influenza virus production in serum containing and serum-free media. Vaccine, 2006, 24 (35-36) :6074-6087.
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10 Holman DH, Wang D, Raja NU, et al. Multi-antigen vaccines based on complex adenovirus vectors induce protective immune responses against H5N1 avian influenza viruses. Vaccine (2008), doi:10.1016/j.vaccine，2008，02.053.
11 Bruijn IA, Nauta J, Gerez L, et al. The virosomal influenza vaccine Invivac: immunogenicity and tolerability compared to an adjuvanted influenza vaccine (Fluad) in elderly subjects. Vaccine, 2006,24(44-46):6629-6631.
12 Treanor JJ, Schiff GM, Hayden FG, et al. Safety and immunogenicity of a baculovirus-expressed hemagglutinin influenza vaccine: a randomized controlled trial. JAMA,2007,297(14):1577-1582.