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【摘要】 目的 观察间歇负重游泳训练对大鼠纹状体cAMP浓度的影响。方法 雄性SD大鼠30只，随机分为对照组、运动后即刻组、0.5h组、1h组、2h组、4h组，建立大鼠间歇负重游泳训练模型，采用双抗体酶联免疫吸附法 ELISA法测定大鼠纹状体cAMP浓度。结果 （1）同对照组相比，即刻组、1h组、2h组、4h组cAMP值均升高且差异有非常显著性(P<0.01)。0.5h组cAMP值较对照组为低，差异也有非常显著性(P<0.01)。（2）间歇负重游泳训练后即刻，大鼠纹状体cAMP浓度较对照组明显升高，之后0.5h时急剧下降，且低于对照组水平。1h时cAMP浓度值达到最高值，2h时cAMP浓度较1h时显著下降，但仍高于对照组水平。4h时其浓度又有所升高，整个浓度变化曲线呈锯齿形。结论 间歇负重游泳训练后纹状体cAMP浓度变化具有时相性；间歇负重游泳训练可激活大鼠纹状体环磷酸腺苷(cAMP)通路，进而影响机体的后续反应。
【关键词】 纹状体；cAMP；间歇负重游泳运动
【中图分类号】 R-332 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2010)01-0001-04
Effects on contents of cAMP in striatum of rats with intermittent load swimming
ZHANG An-min,ZHANG Qing-yuan, YU Fang, et al.
Health Sciences Institute,Shanxi University of Finance and Institute,Taiyuan 030006,China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of intermittent load swimming on the contents of cAMP in striatum of rats. Methods Thirty male SD rats were randomly divided into the control group,the different groups that were measured at 0 h,0.5 h,1 h,2 h,4 h.To establish the trainning model of intermittent load swimming in rats, and to examine the contents of cAMP by using the method of ELISA. Results 1. The cAMP contents in striatum of rats in different moment after intermittent load swimming had higher level than control group(P<0.01) but in 0.5 h which had lower level than control group (P<0.01).2. At the moment of intermittent load swimming finished, the cAMP contents in striatum of rats was obviously higher than control group, then dropped rapidly and was lower than the level of control group at 0.5 h after swimming finished. After that, the cAMP contents rising rapidly and reach the peak at 1h after swimming finished, then the cAMP contents dropped, at 2 h after swimming finished,the level was still higher than that of control group. The cAMP contents increased after a little.The change figure of cAMP contents appears the shape of serrated. Conclusion There must be a phasic change in the contents of cAMP. Intermittent load swimming could influence the cAMP signaling pathway in striatum of rats with effecting the body's response.
【Key words】 striatum；cAMP；intermittent load swimming
纹状体是基底神经节的主要组成部分，参与机体各种不同的行为活动，对机体的运动功能发挥重要的调节作用。cAMP是细胞内第二信使，可介导多种细胞内激素、神经递质及其他信号分子，广泛参与人体各种生理、病理活动，调控组织细胞内一系列生理、生化过程。但纹状体对机体运动的调节作用是否与cAMP的介导有关，尚未得到证实。本文通过建立大鼠间歇性负重游泳运动模型［1～3］，对大鼠间歇性负重游泳训练后多个时刻点纹状体cAMP浓度进行测试与分析，以探讨间歇性负重游泳训练引起的机体应激过程及其疲劳恢复机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组 实验动物：SD成年雄性大鼠30只，鼠龄3个月，体重250～300g，由山西医科大学动物实验中心提供。饲养条件：分笼饲养，每笼4只，自由饮食，自然昼夜节律光照，室温（20±5）℃。相对湿度在40％～60％。随机分为对照组（n=5只）和间歇组（n=25只）。
1.2 训练造模 采用负重游泳训练方式。游泳条件：塑钢游泳池，150cm×60cm×70cm，水深为大鼠身体长度的2倍，水温保持在33℃～36℃之间。正式训练前运动组大鼠进行3天适应性游泳训练，每天1次，时间依次分别为15min、20min、30min。随后开始正式的游泳运动训练6周。间歇训练组：大鼠负自身体重5%的重物游泳，每游6min休息4min，每天连续进行10组，每日1次。对照组：不进行任何训练，常规饲养。
1.3 取材 最后一次游泳后，持续组大鼠按运动后即刻、0.5h、1h、2h、4h五个时段分别依次取材，操作如下：大鼠腹腔2%戊巴比妥钠麻醉（40mg/kg），断头，冰上取脑，置于-80℃液氮冷藏。对照组操作同上。从液氮取出大鼠脑组织，复温至常温。根据大鼠立体定向图谱, 分离脑组织切取大鼠纹状体组织约50～100mg，置于离心管，按10mg:200μl比例加入0.01M PBS液，用超声波细胞粉碎机将其制成乳白色悬液，12000r/min离心10min，取上清液放入-4℃冰箱保存备用。
1.4 测定方法 cAMP浓度的测定均采用双抗体酶联免疫吸附法（Enzymes linked immunosorbant assays,ELISA法），大鼠环磷腺苷cAMP ELISA试剂盒购自美国R·B公司,均严格按说明书进行操作。检测仪器采用Benchmark酶标仪（BIO-RAD公司）。
具体操作步骤：（1）加样：将100μl标准品、100μl标本加入相应反应板孔中；（2）轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育90min；（3）洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μl洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次；（4）每孔加入100μl 1×Biotin。轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育60min；（5）洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μl洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次；（6）每孔加入100μl 1×HRP。轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育30min；（7）洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350μl洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次；（8）每孔加入50μl显色剂A和50μl显色液B, 轻轻混匀10s，37℃暗处温育（15±10）min；（9）每孔加入100μl 终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30s；30min内在450nm处读OD值。（10）以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。并根据样本的OD值查出其浓度。或用回归方程计算其浓度。
1.5 统计学方法 采用SPSS12.0软件对实验数据进行统计处理。所有数据均用平均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析。
2 实验结果
2.1 实验结果显示 见表1,对照组大鼠纹状体cAMP浓度值为（1.538±0.159）pmol/ml，间歇性负重游泳训练后即刻组大鼠纹状体cAMP浓度值为（5.095±0.292）pmol/ml,0.5h组cAMP浓度值为（0.573±0.187）pmol/ml，1h组cAMP浓度值为（6.207±0.251）pmol/ml，2h组cAMP浓度值为（3.007±0.353）pmol/ml，4h组cAMP浓度值为（4.833±0.240）pmol/ml。与对照组相比，即刻组、1h组、2h组、4h组cAMP值均明显升高且差异有非常显著（P<0.01）。0.5h组cAMP值较对照组为低，差异也有非常显著性（P<0.01）。如表1。表1间歇性负重游泳训练后不同时刻大鼠纹状体 注：与对照组比较，*P<0.05；**P<0.012.2 从时效性来看 见图1。间歇性负重游泳训练后即刻，大鼠纹状体cAMP浓度较对照组明显升高，之后0.5h时急剧下降，低于对照组水平。1h时cAMP浓度值达到最高值，2h时cAMP浓度较1h时显著下降，但仍高于对照组水平。4h时其浓度又有所升高，整个浓度变化曲线呈锯齿形。 图1间歇性负重游泳训练大鼠纹状体cAMP浓度变化图
3 讨论
cAMP是细胞内第二信使，参与体内多种生理过程。神经组织中内含高水平的cAMP及其代谢调节酶。在生理状态下，神经细胞中cAMP由三磷酸腺苷(ATP)经腺苷环化酶(Ac)催化生成，由磷酸二酯酶(PDE)降解，二者的功能状态维持神经细胞cAMP水平稳定［2］。研究表明：疾病、运动、药物等多种刺激因素均可引起神经细胞内cAMP浓度发生改变继而引发后续各种反应［3～5］。cAMP的最主要的效应分子是蛋白激酶A（PKA）,胞内信使cAMP产生以后，可激活PKA，后者再磷酸化靶蛋白，将其激活或钝化。这些被磷酸化的靶蛋白往往是关键性调节酶、重要功能蛋白质或转录因子，因而可以介导细胞外信号调节代谢、基因转录等细胞效应。当cAMP的信号终止后，靶蛋白的活性则在蛋白质磷酸化作用下恢复原状。
cAMP系统在神经组织，特别是在突触神经传递上有重要意义。cAMP不仅参与神经节突触传递，还可以调节突触前末梢的递质释放。研究证实：适宜的运动可以引起脑内突触前膜多巴胺，5-HT等神经递质浓度的增加［6］，这些递质作为细胞间传递信息的第一信使，作用于突触后膜上相应受体并激活AC,在突触后膜合成cAMP，进而激活PKA,通过膜蛋白的磷酸化改变膜对离子的通透性，从而影响神经细胞的兴奋性。
纹状体是基底神经节的主要组成部分，参与机体各种不同的行为活动，对机体的运动功能发挥重要的调节作用。如随意运动的稳定、肌张力的调节和躯体运动的协调等都与其功能有密切联系。其对运动功能的调节主要依赖于其内部丰富的多巴胺能神经支配，这些多巴胺能神经元主要来源于中脑黑质区(SN)和腹侧背盖区(VTA)，其神经末梢释放的多巴胺(DA)作用于纹状体内的Υ-氨基丁酸(GABA)能、乙酰胆碱(Ach)能神经元，调节这些神经元的活动。
多巴胺主要参与对躯体运动，精神情绪活动，垂体内分泌功能以及心血管功能等的调节。其受体有多个亚型。D1,D5受体激活后可升高cAMP水平。D2,D3,D4受体激活后则降低cAMP水平。有研究证实，一次性力竭运动和游泳耐力训练均可使纹状体内多巴胺的浓度增加，其合成和分解代谢都增加［7］。运动应激可能是通过纹状体内多巴胺分泌的变化引起纹状体内神经细胞cAMP浓度变化，使纹状体内的7-氨基丁酸(GABA)能、乙酰胆碱(Ach)能神经元兴奋性发生改变，继而影响整个机体的运动疲劳恢复过程。本实验把间歇性负重游泳训练作为应激源，观测运动后不同时刻纹状体cAMP浓度变化，结果表明：间歇性负重游泳训练后大鼠纹状体cAMP浓度变化存在一定时效性，其过程可能与由纹状体内多巴胺浓度变化或其不同受体被激活有关。应当引起注意的是：间歇性负重游泳运动后0.5h大鼠纹状体cAMP浓度低于对照组正常生理水平，其机理值得深究。
运动后纹状体cAMP浓度变化曲线说明，cAMP作为第二信使密切参与运动应激引起的生理生化反应。神经细胞信号传导过程极为复杂，其转导机制很少是简单线性的通路，而多是通过多条信息转导的分支与汇聚来实现的。而且转导通路中可能还存在具有促进作用的正反馈环和抑制作用的负反馈环，对信号转导过程进行调节。因此，间歇性负重游泳训练后大鼠纹状体cAMP浓度时程变化必然是多种神经细胞信号整合的结果，绝非仅受单因素影响，其机理有待进一步研究探明。
【参考文献】
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