羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增

    探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增分化良好的羊软骨细胞的方法。［方法］将培养的羊软骨细胞应用Cytodex3 微载体在旋转生物反应器(RCSS) 内，进行动态培养, 应用倒置显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。［结果］关节软骨细胞于1 d内贴附于Cytodex3微载体表面,细胞初期为圆球形、半球形凸起，逐渐向周围伸展，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期,细胞密度可达最初接种的15～17倍，在微载体上收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。［结论］利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,可为构建组织工程化人工软骨提供大量活性、分化良好的软骨细胞。

    关键词：生物反应器；  微载体；  软骨细胞培养

    A quick way in vitro for amplification of goat chondrocytes by RCSS∥ZHANG Li,GUO Quanyi,SUI Xiang, et al. Department of Orthopaedics, General Hospital of Chinese People′s Liberation Army, Beijing 100853

    Abstract：［Objective］To establish a method for obtaining welldifferentiated goat chondrocytes quickly in large scale by RCSS using microcarriers technique. ［Method］Articular chondrocytes were harvested from goat by sequential digestion with trypsin and collagenase , and then grown in RCSS bioreactor culture system which contained the Cytodex3 microcarriers in the culture medium (DMEM) . Growth of chondrocytes on Cytodex3 microcarriers was observed dynamically under phase contrast microscope . Immunocytochemical analysis was performed for type Ⅰcollagen and type Ⅱcollagen. ［Result］The articular chondrocytes attached rapidly to the surface of Cytodex3 microcarriers. Quick growth of these cells was observed after they fully spread onto the microcarriers. The density of chondrocytes increased by 15～17 times in later stage of culture as compared with the initial density. The harvested chondrocytes had no detectable staining for collagen type Ⅰ, but stained intensively for collagen type Ⅱ. ［Conclusion］Microcarrier culture of chondrocytes can yield a large quantity of goat cells within a short time ,which will be of benefit for banking cartilage cells for reconstruction of impaired cartilage by way of tissue engineering.

    Key words: Cartilage;  Tissue engineering;  Microcarrier;  Cell culture

     软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞成分，它分散于软骨基质中，所占体积不足软骨组织体积的5%。软骨细胞在维持软骨的完整性及关节软骨的负重功能方面起着重要作用，因此软骨细胞的研究是软骨组织工程研究的重要组成部分，而软骨细胞的扩增是软骨组织学工程的首要问题。常用的扩增手段是单层软骨细胞培养。由于常规单层软骨细胞培养存在细胞扩增数量有限及去分化等现象,因此,近年来科研人员对应用微载体技术规模化生产软骨细胞进行了研究［1，2］。本研究通过羊的软骨细胞在微载体上扩增培养的观测，致力于建立一种理想的软骨细胞培养体系，为进一步建立人体软骨细胞的大规模扩增提供参考。

    1  材料和方法

    11  材料

    高糖型DMEM培养基为Gibco公司产品，HEPES、L-脯氨酸、维生素C、Ⅱ型胶原酶、Cytodex3均为Sigma公司产品，胎牛血清为元亨圣马公司产品,旋转生物反应器购于Synthecon 公司, Olympus倒置显微镜为Olympus公司。

    12  羊软骨细胞的分离、培养

    选中国成年山羊，在无菌条件下切取肩关节软骨, 于洁净工作台上用D-Hanks液冲洗多次，洗去粘染的的血液。用眼科剪将关节软骨剪成1mm3大小，加入10倍体积的0.2% Ⅱ型胶原酶，37℃搅拌消化2～3 h。控制消化时间,观察软骨松散、大部分细胞游离时, 用吸管用力吹打使软骨块彻底分散。收集细胞悬液经滤网过滤并离心弃上清,沉淀用30倍的DHanks平衡液清洗3遍，把软骨细胞悬浮于20%胎牛血清的DMEM培养基（含VitC 、Lproline、非必需氨基酸）中，在37℃、5% CO2的培养箱内培养，细胞贴壁后,隔日换液。待80%的软骨细胞融合时进行传代。

    13  Cytodex3 微载体预处理

    取干重微载体珠50 mg，放入10 ml的干净玻璃瓶中。向瓶中加入不含钙和镁离子的PBS 10 ml，室温下至少孵育3 h以膨胀微载体珠，用巴氏吸管弃去上清液。用不含钙和镁离子的PBS清洗微载体2次，弃去PBS，再加入新鲜不含钙和镁离子的PBS 10 ml，高压灭菌20 min，吸除上清液，微载体用培养液清洗。 置于4 ℃冰箱中备用。

    14  在旋转生物反应器内培养软骨细胞

    先后将微载体50mg及软骨细胞（最终浓度5～8×105/ml）加入到10 ml体积的RCSS培养容器中,并补加DMEM 培养基至容器内充满液体为止。把接种细胞的容器按顺时针方向缓慢转动小心连接于旋转底座。把旋转底座放入培养箱，以10～12 r/min的速度开始旋转容器。允许旋转5 min以充分混合细胞，停止容器旋转5 min。再旋转容器5 min，再停止容器旋转5 min。多次重复循环，然后持续旋转容器。整个装置放于5% CO2 孵箱,于37 ℃常规条件下培养,视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量。

    15  细胞形态学观察和计数

    羊软骨细胞分别培养3、6、9、12 d,取样本于倒置显微镜下观察微载体表面软骨细胞生长形态及增值变化情况，消化、分离微载体表面的软骨细胞并用血细胞计数板计数，描记细胞培养生长曲线。同时用相同浓度的软骨细胞单层培养方法，分别于3、6、9、12 d观察细胞生长形态及增值变化情况，描记细胞培养生长曲线。

    16  免疫细胞化学分析

    将在微载体上生长的软骨细胞进行消化并收集后,分别与Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆抗体共同孵育，以 DAB 为底物应用免疫过氧化物酶法显色,阳性染色为棕色反应。以第1代羊关节软骨细胞作为Ⅱ型胶原阳性细胞对照,人滑膜细胞作为Ⅰ型胶原阳性细胞对照。人淋巴细胞作为Ⅰ型和Ⅱ型胶原的阴性对照细胞。

    2  结  果

    21  细胞在Cytodex3微载体表面贴附生长情况

    细胞接种10 h后,大部分开始贴附微载体表面, 呈球形、半球形凸起。细胞开始向四周伸展，形态变为不规则扁平状, 伸出伪足,紧附于微载体表面, 细胞间可见基质沉积。随时间延长，软骨细胞在微载体上迅速增长，微载体表面出现不规则形状的细胞团，表面高度不平，细胞之间紧密相连，倒置显微镜下细胞处于不同的层面，表现出同一层面不同的折光强度，至第12 d时细胞己长满微载体表面,细胞间紧密接触（图1）。

    22  软骨细胞在培养瓶内生长情况

    细胞接种10 h后,开始贴壁, 刚贴壁的细胞为短梭形或多角形。随着时间延长，贴壁细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大，细胞主要为多角形或鹅卵石样。随培养时间延长，细胞密度增加，细胞贴壁达80%传代。

     23  羊软骨细胞生物反应器培养及单层培养生长曲线(图2)

    在第1、3、6、9、12 d,分别从RCSS容器及普通培养瓶中收集软骨细胞并计数，作生长曲线如图2。台盼蓝染色排除试验显示，从微载体上回收的软骨细胞具有活力。血细胞计数板计数，可见软骨细胞于RCSS接种后的第3 d起生长加速，至第12 d细胞密度达到最高值，约为最初接种的15～17倍。

    24  组织学及免疫细胞化学检查分析

    分别取各时间点微载体培养的细胞，行组织学及免疫细胞化学检查分析，发现收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结果表明在微载体上培养的软骨细胞具有正常的分泌功能。

    图2  软骨细胞旋转生物反应器培养及单层培养生长曲线3  讨  论

    近年来,组织工程研究取得了突破性进展，部分再造的组织或器官已经开始进入或即将进入临床应用,软骨组织工程产品也有望近期进入临床应用。由于异体软骨细胞移植容易造成免疫排斥,传染供体的固有疾病,因而软骨组织工程领域多提倡用自体的软骨细胞进行治疗［3］ 。由于自体软骨细胞提供的量有限，实验和临床需要在较短时间内大量扩增，才能满足要求。因此科研人员开展了用有限的种子细胞进行大规模扩增的研究。本实验用RCSS 进行软骨细胞体外培养的研究表明，利用微载体生物反应器能够短时间内得到大量的并保持原有表型的软骨细胞。

    在常规单层软骨细胞培养过程中，二维的环境和坚硬的基质会改变基因表达和阻止分化，导致细胞扩增数量有限及去分化等现象。用RCSS 进行微载体软骨细胞培养，整个培养容器由电机驱动沿水平轴旋转，培养基以及细胞颗粒随容器一起旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，不与容器壁相互碰撞，细胞与营养物质易于均质分布，显著改善体外培养的营养交换［4］，微载体本身又能够为贴壁依赖性细胞体外生长提供更大的表面积(Cytodex3 10 g提供约4600 cm2 的表面积)［2,5］,这些细胞培养微环境的变化，提供了细胞聚集、快速三维生长和分化的条件。本实验的结果也证实了这一点。

    软骨组织工程研究用的种子细胞不仅需要细胞数量达到一定的规模,而且还要求种子细胞具有正常的分化状态。本研究对各时间点微载体上的软骨细胞进行了收集,细胞形态学观察，可见细胞呈球形贴附于微载体的表面，特别是第10 d球形软骨细胞几乎爬满每个微载体的表面，细胞形态的变化和其功能是相关的，软骨细胞形态的变化伴随分泌Ⅱ型胶原及蛋白聚糖功能的变化，微载体环境培养中，软骨细胞球形形态的维持，象征着基因表达和分化的稳定。对收集的软骨细胞进一步进行了细胞免疫化学分析，结果表明,在微载体上收集到的软骨细胞主要分泌Ⅱ型胶原,而很少分泌Ⅰ型胶原。这一结果进一步证实选用RCSS微载体悬浮培养系统大量扩增软骨细胞是解决组织工程等种子细胞制备的一种可行有效的方法。本研究为软骨细胞的大规模培养提供了实验基础。

    参考文献：

    ［1］  徐小平,高　毅,杨继震. Cytodex3 微载体高密度培养人肝细胞系CL25［J］. 中华实验外科杂志, 1999 ,16 (1) :80-81.

    ［2］  单建林，许健中，周强，等.微载体技术体外扩增人骨髓间充质干细胞［J］. 中国矫形外科杂志, 2004,12 (15) :1158-1160.

    ［3］  Hardingham T ,Tew S ,Murdoch A. Tissue engineering :chondrocytes and cartilage［J］. Arthritis Res,2002,4 (Suppl):63-68.

    ［4］  Nielsen L K. Bioreactors for hematopoietic cell culture［J］. Annu Rev Biomed Eng,1999,1 :129-152.

    ［5］  赵强, 王常勇, 王永红,等.软骨细胞在微载体中的培养和快速扩增［J］. 军事医学科学院院刊, 2001,25(3):219-222.