椎间失稳诱发椎间盘退变的病理学观察△

【摘要】  　　［目的］探讨新西兰大白兔腰椎关节突关节破坏能否诱发椎间盘退变的组织学改变。［方法］30只新西兰大白兔，体重2.25～2.95 kg，雄性。随机分为骨性手术组和软组织手术组。软组织手术组仅骨膜下剥离L3～7的椎旁肌肉；骨性手术组完整切除L4、L5双侧下关节突、L5棘突，保留L5、L6上关节突。骨性手术组L4、5、L5、6椎间盘为实验组椎间盘，上下相邻的L3、4、L6、7为自身对照组椎间盘。软组织手术组L4、5、L5、6椎间盘为实验对照组椎间盘。术后1、2、4、及8个月行光学显微镜、电子显微镜检查。［结果］正常新西兰大白兔椎间盘由纤维环、髓核组成，纤维环胶原纤维排列规则，软骨样细胞镶嵌其中。髓核组织由大量细胞外基质和散在的细胞组成。随着术后时间延长，实验组椎间盘纤维环胶原纤维排列紊乱，细胞数进行性减少。术后4个月，实验组椎间盘开始出现大量退变细胞，表现为外形不规则，细胞膜破裂，线粒体肿胀，细胞核位于周边，核浓缩，核膜皱缩，异染色质较正常增加，核仁消失。术后8周实验组椎间盘开始出现大量死亡细胞，表现为溶酶体明显增多，细胞核扭曲，粗面内质网扩张，线粒体空泡化，死亡细胞外周的“巢”增厚呈多层排列，致密颗粒增多。［结论］L4、5、L5、6关节突关节破坏导致椎间失稳，椎间失稳后可以诱发出椎间盘退变的组织学改变。

【关键词】  椎间盘 退变 组织学

　　Histological observation of intervertebral disk degeneration caused by bilateral zygapophysial joints destruction∥

　　HUANG Zongqiang,LIU Shangli,ZHENG Zhaomin.

　　Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China
   
　　Abstract：［Objective］To study whether intervertebral disk degeneration can be induced by destroying bilateral zygapophysial joints of NewZealand rabbit.［Method］Thirty male NewZealand rabbits were randomly divided into operation group on the bone and operation group on the soft tissue.In operation group on the bone,L4 and L5 inferior articular processes were en bloc excised,L5 and L6 superior articular processes were retained.In the operation group on the softtissue,Only L3 to L7 paravertebral muscles were stripped.In operation group on the bone,L4、5 and L5、6 intervertebral disks acted as experimental group;L3、4 and L6、7 acted as selfcontrol group.In the operation on the soft tissue,L4、5 and L5、6 acted as experimental control group.One,two,four and eight months postoperation,histological and ultrastructure organizations of intervertebral disks of NewZealand rabbits were performed.［Result］The normal rabbit discs formed a very complex system,with an outer anulus fibrosus surrounding a central nucleus pulposus in which collagen fibers aligned parallelly and intervertebral disk cells distributed evenly.Collagen fibers derangly aligned and intervertebral disk ceils declined with time postoperation.At the end of four months postoperation,many degenerative cells were found in the study group,which features as irregular cell contours,swelling chondrosome,rough endoplasmic reticulum,and condense nucleus located in the cellular nucleus.Eight months after operation,many dead cells were found.Cytolysosomes increased,cellular nucleus became twisted,rough endoplasmic reticulums swelled,and chondrosome became vacuolization.Dead intervertebral disk cells were located in nidi which were made of multilayer degenerative collagen fibers.［Conclusion］Histological changes of intervertebral disk degeneration can be induced by destroying L4、5 and L5、6 zygapophysial joints of NewZealand rabbit.
   
　　Key words：intervertebral disk;  degeneration;  histology

　　制作动物模型，是开展病因、发病机理和治疗等方面研究的重要途径。人类椎间盘及同节段的双侧关节突关节组成脊柱运动单位的三关节复合体，文献〔1〕报道破坏椎间盘结构会造成同节段关节突关节增生、骨赘形成等。本研究利用这一特性，破坏新西兰大白兔关节突关节，观察造成椎间盘退变（intervertebral disk degeneration，IVDD）组织学改变。
   
　　1  材料和方法
   
　　1.1  动物分组及手术方法
   
　　30只新西兰大白兔，质量2.05～2.95 kg，雄性。随机分组，骨性手术组20只，用氯氨酮35～50 mg／kg、安定3～5 mg／kg联合肌肉注射，用50 ml注射器针头在X线片下透视定位后，俯卧位，以定位点为中心做长约5 cm的纵形正中切口，骨膜下剥离L4～6椎旁肌，暴露双侧关节突关节。切除L4、L5双侧下关节突、L5棘突，保留L5、L6完整的上关节突（图1）。L4、5、L5、6椎间盘做为实验组椎间盘，上下相邻的L3、4、L6、7做自身对照椎间盘；软组织手术组10只，不切除骨性组织，仅骨膜下剥离相同范围的肌肉，L4、5、L5、6椎间盘为实验对照组椎间盘。术后分笼饲养，自由活动。

　　图1手术示意图（略）

　　1.2  光学显微镜观察
   
　　术后1、2、4、及8个月骨性手术组各取4只、软组织手术组各取2只进行检查。用上法麻醉后，耳缘静脉注入5～10 mL空气致死。迅速切取腰椎全段，用咬骨钳切除椎板及附着肌肉，分别取出L3、4、L4、5、L5、6、L6、7椎间盘（包括上、下终板）。用4％多聚甲醛溶液固定48～72 h，用0.5 mol／L乙二胺四乙酸（pH=7.4）脱钙2周，针刺法检测脱钙程度。再次修整标本，行梯度酒精脱水、二甲苯固定、石蜡包埋，椎间盘水平面、矢状面及冠状面切片，厚5 μm。做HE、Masson三色、高碘酸-无色品红染色。Olympus公司BH-50光学显微镜下观察。
   
　　1.3  电子显微镜观察
   
　　（1）扫描电子显微镜观察：同法将实验动物处死后，取出L3、4、L4、5、L5、6、L6、7椎间盘，去除上、下终板。①样品固定：用2％～4%戊二醛（pH=7.3～7.4）低温初固定2～4 h。用1％锇酸（pH=7.3～7.4）后固定1～2 h（4 ℃）。②梯度丙酮溶液行样品脱水；③样品干燥及导电处理后观察。（2）透射电子显微镜观察：分别取髓核、纤维环标本，进行样品固定后切片行醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色观察。
   
　　2  结果
   
　　2.1  光学显微镜观察
   
　　大体观察：椎间盘呈肾形，前后窄，两侧宽，由髓核和纤维环组成，髓核位于近似中央，周围有纤维环包绕，纤维环以腹侧处最厚，背侧处最薄。低倍镜下观察：髓核组织由大量细胞外基质和散在的细胞组成。其上、下方为薄层软骨终板，软骨终板由透明软骨组成，软骨终板外侧与椎体松质骨紧密接触，可见毛细血管分布，多数位于中央，周围较少。纤维环组织分层排列，层与层之间纤维走行方向交错。高倍镜下观察：髓核细胞数量较少，分布稀疏，细胞体积大，细胞质染色深。纤维环软骨样细胞多呈圆形、梭形，软骨终板由透明软骨细胞组成，呈圆形、椭圆形，可见同源细胞群。
   
　　术后1、2个月，实验组椎间盘高度下降不明显，与实验对照组椎间盘相比，髓核内细胞数量减少，细胞外基质环网状结构崩解。术后4个月，实验组椎间盘纤维环胶原发生玻璃样变性，间隔变得模糊，纤维间出现裂隙。纤维环软骨样细胞开始向纤维细胞转变。髓核细胞数量进一步减少，分泌细胞外基质能力进一步下降，酸性和混合性黏多糖染色变浅。术后8个月，实验组椎间盘髓核内细胞稀少，细胞外基质皱缩、裂变、分散，酸性和混合性黏多糖染色明显变浅，纤维环裂变断开，髓核组织向背侧纤维环内疝入，椎间盘高度下降，疝入髓核挤压纤维环，病灶周围出现炎症细胞，毛细血管数量明显增加（图2）。

　　图2骨性手术组椎间盘术后8个月水平面观：髓核疝出挤压纤维环，病灶周围出现炎症细胞，毛细血管增多  （50×）（略）

　　2.2  扫描电子显微镜观察
   
　　正常新西兰大白兔椎间盘纤维环中胶原纤维密集，“冰针”状相互编织平行排列。胶原纤维束间有间隙。术后4个月，实验组椎间盘纤维环胶原纤维变得稀疏，尤以深层明显，排列无序，纤维形状不规则，频繁分枝和吻合，形似蜘蛛网。术后8个月，椎间盘胶原纤维明显稀疏，僵直，欠饱满，表面不光滑，有凹迹。许多纤维上出现断裂、磨损、裂隙和不规则空洞。
   
　　2.3  透射电子显微镜观察
   
　　正常新西兰大白兔椎间盘纤维环软骨样细胞呈圆形或梭形。细胞质内可见散在分布的粗面内质网，其上附有核蛋白小体，线粒体数量较多，未见到明显的高尔基复合体。细胞核外形圆滑，染色质均匀，常染色质占绝对优势，核中央见清晰的核仁。胶原纤维呈现相互平行、有规律的排列。正常髓核细胞，外形比较规则，细胞核较大，细胞质内有较丰富的粗面内质网，上有核蛋白体，线粒体数目较少，长圆形，双层膜结构，嵴不明显，核内匀质，常染色质占绝对优势，核仁清晰。髓核中的胶原纤维排列疏松，纤维较长，其间连接较少。术后2个月，实验组椎间盘髓核中细胞变得稀疏，基本上是活性软骨样细胞。细胞核呈卵圆形，核膜完整、光滑，细胞核内常染色质占优势，细胞质中粗面内质网较多。术后4个月，实验组椎间盘纤维环细胞开始不规则，细胞浆内密度变高并不均匀，内有较丰富的肿胀粗面内质网，核蛋白体部分脱落，可见溶酶体，核染色加深，异染色质丰富，核仁消失，部分染色质贴附于核膜胶原纤维。退变的细胞中，外形极不规则，整个细胞染色加深，细胞浆内基本无细胞器，只见较多初级和次级溶酶体，核固缩，异染色质占绝对优势，出现多核现象。实验组椎间盘髓核细胞外形不规则，细胞膜破裂，线粒体肿胀，嵴不清楚，细胞核位于周边，呈不规则形，核浓缩，核膜皱缩，染色不均匀，异染色质较正常增加，核仁消失（图3）。术后8个月，实验组纤维环中出现大量的退变细胞，表现为溶酶体明显增多，细胞核扭曲，常染色质凝集成块，分布于核膜下或散在分布，胞浆基质密度加深，粗面内质网扩张，线粒体空泡化，整个细胞体积缩小。出现较多死亡细胞，细胞外周的“巢”增厚呈多层排列，致密颗粒增多（图4）。髓核中出现变性胶原原纤维，扭结成毛线团状，亦可呈指纹状或堆聚成片块状。另外可见高电子密度细颗粒的钙化点，沿胶原原纤维纵轴排列或沉积其上，亦可聚集成斑块状。
 
　　图3术后4个月，细胞膜破裂，细胞器肿胀，细胞核位于周边，呈不规则形  （4 000×）（略） 

　　图4术后8个月，出现死亡细胞，细胞外基质崩解，出现许多碎片  （5 000×）（略）

　　3  讨论
   
　　3.1  新西兰大白兔椎间盘组织学结构及生物力学特性
   
　　正常新西兰大白兔椎间盘由上下软骨终板及中间的纤维环和髓核构成，纤维环由胶原、水、少部分蛋白多糖及细胞组成，胶原以Ⅰ、Ⅱ型胶原为主；髓核主要有蛋白多糖、水及细胞组成。纤维环中的细胞主要为成纤维细胞及软骨样细胞；髓核中主要为软骨样细胞，偶见脊索细胞。纤维环中的胶原纤维密集，“冰针”状，相互编织平行排列。长椭圆形细胞排列于纤维之间。细胞质内可见散在分布的粗面内质网，其上附有核蛋白小体，线粒体数量较少，未见到明显的高尔基复合体。细胞核外形圆滑，染色质均匀，常染色质占绝对优势，核仁清晰。髓核中的胶原纤维排列疏松。髓核细胞细胞质内有较丰富的粗面内质网，上有核蛋白体，双层膜结构的线粒体数目较少。细胞核较大，常染色质占绝对优势，核仁清晰。椎间盘这种有序的组织学结构，维持着椎间盘正常的生物力学性质——即髓核承受压应力，纤维环承受张应力。正常椎间盘与同节段的双侧关节突关节有机组合维持正常的椎体节段运动。
   
　　3.2  腰椎失稳对椎间盘组织学的影响
   
　　3.2.1  椎间盘光学显微镜下结构改变
   
　　术后1、2、4、8个月，实验动物的相关椎间盘发生了一系列变化，术后1、2个月，椎间盘髓核内的细胞数量开始减少，细胞结构出现破坏。术后4个月，髓核细胞数量进一步减少，细胞外基质皱缩，产生裂隙，糖染变浅，纤维环发生胶原变性，出现裂隙。术后8个月，髓核内细胞少见，基质进一步分散崩解，纤维环破裂加重，髓核组织突入，椎间盘高度下降，组织学改变已基本类似于人类的椎间盘退变性疾病〔2、3〕。本结果说明关节突关节破坏将出现椎间盘生物力学改变，在这种不正常生物力学影响下，椎间盘将表现为正常髓核细胞合成减少，破坏增多，髓核细胞数随着术后时间延长进行性下降。细胞数量减少将出现细胞外基质合成下降，破坏增多，组织学上将出现髓核基质皱缩、裂隙，糖染变浅。糖染变浅说明蛋白多糖和水分的含量在减少，将会引起胶原-蛋白多糖基质的弹性和强度丧失，导致应力防御机理减退。正常纤维环的胶原排列不能维持，出现排列紊乱的纤维环结构，这种纤维环排列随着不断运动的慢性损伤将出现纤维环裂隙，退变髓核组织将沿着裂隙纤维环突出成为椎间盘突出。
   
　　3.2.2  椎间盘超微结构改变
   
　　IVDD的早期，光学显微镜观察尚未出现改变时，可通过电子显微镜观察椎间盘中发生的超微结构变化。术后4个月，实验组椎间盘纤维环胶原纤维变得稀疏，排列无序，形似蜘蛛网。胶原中开始出现大量活性差的细胞，外形极不规则，整个细胞染色加深，胞浆内基本无细胞器，只见较多初级和次级溶酶体，核固缩，异染色质为绝对优势，出现多核现象。术后8个月，纤维环胶原纤维出现断裂、磨损、裂隙和不规则空洞。髓核中出现较多死亡细胞，体积变小，核固缩成团或碎裂成多块，散布于细胞质中，细胞质模糊不清，出现空泡，细胞膜不完整或缺如。死亡细胞外周的“巢”增厚呈多层排列。与文献报道IVDD的超微结构改变类似〔4〕。随着术后时间延长，溶酶体逐渐增多，说明细胞破坏逐渐增多。线粒体嵴变平坦，细胞质中出现空泡说明细胞活力下降，合成细胞外基质下降。晚期出现核固缩坏死，外周出现“巢”状增厚的多层排列可能为吞噬坏死细胞产物的初级或次级溶酶体。结合光学显微镜观察，进一步说明关节突关节破坏可以诱导出IVDD模型。

【参考文献】
  　　〔1〕 Fujiwara A,Lira TH,An HS,et al.The effect of disc degeneration and facet joint osteoarthritis on the segmental flexibility of the lumbar spine［J］.Spine,2000,25（23）:30363044.

　　〔2〕 Roberts S,Evans H,Trivedi J,et al.Histology and pathology of the human intervertebral disc［J］.J Bone Joint Surg Am,2006,88（Suppl 2）:1014.

　　〔3〕 Roughley PJ.Biology of intervertebral disc aging and degeneration involvement of the extracellular matrix［J］.Spine,2004,29（23）:26912699.

　　〔4〕 Gruber HE,Hanley EN.Ultrastructure of the human intervertebral disc during aging and degeneration:comparison of surgical and control specimens［J］.Spine,2002,27（8）:798805.

△基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30471746）；广东省科委攻关项目（No.C30702）；教育部霍英东基金青年教师基金（NO.94020）；广东省自然科学基金资助项目（No.36643）；中山大学重点项目启动基金（No.2002-11）

作者单位：郑州大学第一附属医院骨科，郑州 450052；中山大学附属第二医院骨科，广州 510120；中山大学附属第一医院骨科，广州 510089