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【关键词】 可注射性骨组织工程载体研究进展
可注射性骨组织工程兼组织工程和微创外科的理论和技术，具有非侵害或微创修复骨缺损或畸形的优点，并已在临床得到初步应用，具有良好的应用前景。细胞在体内发挥成骨作用，有赖于与适宜的载体结合，既可防止流失，更重要的是提供了一个有利于细胞增殖和分化的微环境。可注射载体除满足一般组织工程载体的要求外，还应满足：（1）体外具有一定的流动性，能通过穿刺或注射针头；植入体内能很好的固定于缺陷部位，阻止细胞迁移出移植区；（2）有可靠的成骨效应，最好具有一定的力学强度；（3）工艺简单，易消毒、保存和操作等。如何获得可靠的载体是该领域发展的关键。现就其研究进展综述如下。
1 富血小板血浆（plateletrich plasma,PRP）
PRP能阻止细胞流失同时在骨缺损区释放一些生长因子和蛋白质促进骨愈合〔1、2〕。黄爱文等〔3〕利用自体PRP、骨髓间充质干细胞（MSCs）和纤维蛋白胶分别构建可注射型组织工程骨，植入兔桡骨节段性骨缺损处，并从放射学方面评价效果；提示复合MSCs的PRP可修复兔桡骨节段性骨缺损。日本Yamada等〔4〕在骨缺损动物实验中以PRP作为体外扩增的自体支架，与单独的PRP、复合骨髓的自体松质骨颗粒为对照，显示PRP能增强新骨的形成，加速新生血管形成，促进骨愈合，且无毒性及免疫活性，认为MSCs复合PRP是一良好的成骨替代品。
国外Ito K等〔5〕在组织和影像学分析基础上对比自体骨、骨替代品（BioOss）、PRP、PRP／MSCs修复骨缺损，2周后检测生物力学强度，维氏硬度值PRP／MSCs＞自体骨＞骨替代品＞PRP。说明可注射组织工程骨在骨重建的早期就表现出良好的组织和生物力学特性。
国外一些学者已将PRP与MSCs同时注入骨缺损修复和牵张成骨术病人中。Kitoh、Robiony M、Hibi H等〔6～8〕分别报道在临床自体MSCs穿刺到骨缺损或延长区，同时注射PRP复合凝血酶和氯化钙。术后证实是一安全、最小侵入的治疗，通过骨聚集再生而缩短治疗时间。认为可注射骨组织工程在成功植入方面能提供稳定和可预期的效果。
2 藻酸盐（alginates）
是一类从褐藻中提取的天然化合物，作为载体，有很好的优越性，承载细胞量大，细胞接近体内的生活状态，可进行营养和代谢物质的交换，有利于细胞基质的分泌和浓度的保持〔9〕。
Chang SC〔10〕等用藻酸珠作为载体在羊体内注射经软骨诱导的MSCs复合物进行成软骨实验获得良好结果，Abbah SA等〔11〕研究从鼠脂肪组织获取的间充质干细胞（ATSCs）在藻酸盐微粒中体内外的细胞成活率及成骨活性。显示藻酸盐微粒能为ATSCs增殖提供三维结构基质，有望成为骨组织工程中可注射载体。
李光辉等〔12〕将体外培养的骨髓MSCs与藻酸盐凝胶复合经皮注射骨缺损处发现较单纯细胞悬液有明显促进骨缺损修复的作用。以上说明该材料的存在，给间充质干细胞的生长增殖及代谢创造了一个良好的微环境，而单纯细胞悬液注射侧不仅没有一个良好的细胞生长代谢的微环境，且缺乏细胞运载体，存在细胞丢失的问题，必将导致细胞量的不足，影响了骨的形成。为可注射性组织工程骨研究提供了依据。
但藻酸盐仍存在体内降解过程难以控制、组成成分不稳定等缺点，且有文献报道在体内由于淋巴细胞和炎症细胞的刺激和诱导可发生免疫性损伤〔13〕。
3 胶原（collagen）
胶原为纤维的组成部分，是细胞外基质（ECM）的重要成分。可用于骨软骨细胞的培养基质。具有适宜的微孔径，而且其分布量大，这些特点赋予材料较好的渗透性，适于营养物质、生物因子扩散及血管长入。
Takamine等〔14〕将成骨细胞混于胶原中，经皮注射于四肢骨牵张后间隙，已被证实推动骨痂形成，加速骨形成。AndereyaS等〔15〕在2006年5月首次临床报道22例自体软骨细胞复合I型胶原治疗膝关节局灶性软骨缺损，随访2年取得较好的临床效果。但需更多的病例收集和长期追踪。
4 聚氧乙烯类
聚氧化乙烯类是具有良好生物相容性的高分子材料，可溶于水，随浓度的增大其黏度也相应增大。在温度改变的条件下固化为水凝胶。它与蛋白质和大部分生物大分子不发生作用，几乎可认为无免疫原性。在一定时间内具有可注射性，注入体内后可固化成型。聚合物在体内6～8周由周围组织吸收后经肾脏排泄。
Sims CD等〔16〕将软骨细胞接种于聚氧化乙烯中形成软骨细胞-聚合复合物，注射到裸鼠皮下培养6～12周形成新的软骨。随后陈富林等〔17〕通过注射方式将聚氧化乙烯水凝胶－骨细胞复合物注入裸鼠体内，经人体标本检查和组织学观察证实，成功地再造出骨组织。商品化的Pluronic是德国巴斯夫公司注册商标，是聚氧化乙烯与丙烯的复合物。
但该类凝胶在常温下可溶于水，从而无法作任何体外的组织培养实验；材料降解时间无法在较大范围内调节，难以适应在不同动物对象及不同组织上应用。
5 纤维蛋白凝胶（fibrin glue）
纤维蛋白是血液在正常状态下凝固的终产物。其单体在凝血酶作用下聚合成具有可塑形、可黏附性、可降解性及生物相容性的立体网状结构，还可调节从液态转变为凝胶的时间〔18〕。聚合时能释放一些因子，进一步促进细胞增殖、黏附和基质分泌。很多学者将其作为实验和临床上种子细胞的基质材料，表明纤维蛋白的存在能够吸引宿主MSCs向缺损区迁移，并促进增殖和分化；并为未分化的MSCs迁入和新生血管的长入提供了良好支架，增加了生长因子和靶细胞的作用面积。源于自身的纤维蛋白凝胶，避免了免疫原性问题，可直接用于临床，具有取材简单、制备方便、韧性好等优点，有巨大的应用潜力〔19〕。
陈克明等〔20〕用兔自体骨髓分离和培养MSCs，扩增后与同种异体纤维蛋白复合在一起，植入股骨关节面上5 mm×10 mm的骨软骨缺损区，对侧缺损区只植入单纯纤维蛋白或留作空白对照。术后12周结果示植入复合物的缺损区再生出典型的透明软骨样结构。对侧缺损区表面仅为纤维组织。Ge W〔21〕利用人MSCs诱导分化后与纤维蛋白黏合剂复合注入裸鼠背部，单独纤维蛋白黏合剂和MSCs作为对照组。6～12周处死后组织学和免疫组化观察实验组有软骨组织形成，而对照组无软骨样组织形成，研究认为MSCs与纤维蛋白复合可运用在可注射软骨组织工程。崔庚〔22〕也证实纤维蛋白可制成注射性组织工程复合物修复骨缺损。
6 脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）
将异种骨进行酸处理，脱去矿物质后留有非胶原蛋白、骨生长因子及胶原的复合物，即成为DBM。它可以制成粉末、颗粒、小块或凝胶等多种形式，均易于塑型。DBM也是一种良好MSCs载体，具有一定的骨引导效能及轻度的骨诱导作用。Wilkins等〔23〕用DBM粉末与骨髓混合经皮穿刺治疗69例骨不连病例,61例痊愈，平均在8.1个月。但该材料难溶于水，注射不便。且保留了骨中的生物活性蛋白成分,DBM仍然有一定的抗原性。
7 羟基磷灰石（hydroxyapatite granules calcified,HA）、三磷酸钙类
HA微粒作为可注射骨组织工程载体的适合性在体内外作了较多的评估性研究。Weissenboeck M〔24〕比较了从红藻中制取的钙化HA微粒大小（分别为10～100 μm，200～500 μm and 600～1 000 μm）在体外对MSCs成骨潜能的影响。结果显示HA微粒大小影响MSCs的成骨潜能，微粒大小在碱性磷酸酶活性和I型胶原的产生有不同的影响。Fischer EM〔25〕在体外用羊骨髓MSCs种植培养在大小分别为212～300 μm、500～706 μm的HA上1周，经皮植入裸鼠4周后发现直径在212～300 μm范围内HA植入区有大量骨形成，且在样本的微孔里有骨髓呈现。而直径在500～706 μm范围内HA植入区无骨形成和骨髓出现。提示HA微粒的大小与微孔隙影响细胞的成骨性，提示200～300 μm大小的HA可被用于可注射组织工程骨的载体成分。
8 几丁质（chitin）及其衍生物
几丁质，是一种广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中的天然多糖。经脱乙酰化反应变成壳聚糖（chitosan）。Hoemann CD等〔26〕将壳聚糖凝胶软骨细胞复合注射入兔软骨缺损处，术后观察有明显修复作用。作者认为此特性通过关节镜注入体内在辅助修复软骨方面有很大的应用前景。
9 其他
文献报道还有琼脂糖凝胶（agarosegel）、聚丙烯延胡索酸酯（PPF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乳酸（PLA）、聚酯类（聚羟基丁酸酯、聚氨基甲酸酯、聚反丁烯二酸酯）等材料，但报道相对较少，需进一步探讨。
10 问题与展望
从现有可注射支架材料的特点及其实际应用情况来看，还面临一些亟待解决的问题：（1）这类材料绝大部分仍处于试验阶段，运用于临床的报道仍为少数；（2）材料缺乏机械强度，大量获取困难、降解时间难以控制等缺点；（3）在体内降解过程和成骨的形成是否适应，不均匀吸收和残留问题及注射载体的时间、频率、最适细胞浓度等，仍有待进一步研究和解决；（4）有些材料的质量直接影响骨组织的形成，需要在材料成分及细胞研究方面分析确认；（5）一些非自体材料多存有免疫原性，可能激发宿主的免疫反应，影响骨软骨的再生。相信随着新的可注射性载体深入研究和材料之间的互相联合应用，理想的可选择的支架材料必将广泛应用于骨软骨组织缺损修复或辅助修复。
【参考文献】
可注射性骨组织工程兼组织工程和微创外科的理论和技术，具有非侵害或微创修复骨缺损或畸形的优点，并已在临床得到初步应用，具有良好的应用前景。细胞在体内发挥成骨作用，有赖于与适宜的载体结合，既可防止流失，更重要的是提供了一个有利于细胞增殖和分化的微环境。可注射载体除满足一般组织工程载体的要求外，还应满足：（1）体外具有一定的流动性，能通过穿刺或注射针头；植入体内能很好的固定于缺陷部位，阻止细胞迁移出移植区；（2）有可靠的成骨效应，最好具有一定的力学强度；（3）工艺简单，易消毒、保存和操作等。如何获得可靠的载体是该领域发展的关键。现就其研究进展综述如下。
1 富血小板血浆（plateletrich plasma,PRP）
PRP能阻止细胞流失同时在骨缺损区释放一些生长因子和蛋白质促进骨愈合〔1、2〕。黄爱文等〔3〕利用自体PRP、骨髓间充质干细胞（MSCs）和纤维蛋白胶分别构建可注射型组织工程骨，植入兔桡骨节段性骨缺损处，并从放射学方面评价效果；提示复合MSCs的PRP可修复兔桡骨节段性骨缺损。日本Yamada等〔4〕在骨缺损动物实验中以PRP作为体外扩增的自体支架，与单独的PRP、复合骨髓的自体松质骨颗粒为对照，显示PRP能增强新骨的形成，加速新生血管形成，促进骨愈合，且无毒性及免疫活性，认为MSCs复合PRP是一良好的成骨替代品。
国外Ito K等〔5〕在组织和影像学分析基础上对比自体骨、骨替代品（BioOss）、PRP、PRP／MSCs修复骨缺损，2周后检测生物力学强度，维氏硬度值PRP／MSCs＞自体骨＞骨替代品＞PRP。说明可注射组织工程骨在骨重建的早期就表现出良好的组织和生物力学特性。
国外一些学者已将PRP与MSCs同时注入骨缺损修复和牵张成骨术病人中。Kitoh、Robiony M、Hibi H等〔6～8〕分别报道在临床自体MSCs穿刺到骨缺损或延长区，同时注射PRP复合凝血酶和氯化钙。术后证实是一安全、最小侵入的治疗，通过骨聚集再生而缩短治疗时间。认为可注射骨组织工程在成功植入方面能提供稳定和可预期的效果。
2 藻酸盐（alginates）
是一类从褐藻中提取的天然化合物，作为载体，有很好的优越性，承载细胞量大，细胞接近体内的生活状态，可进行营养和代谢物质的交换，有利于细胞基质的分泌和浓度的保持〔9〕。
Chang SC〔10〕等用藻酸珠作为载体在羊体内注射经软骨诱导的MSCs复合物进行成软骨实验获得良好结果，Abbah SA等〔11〕研究从鼠脂肪组织获取的间充质干细胞（ATSCs）在藻酸盐微粒中体内外的细胞成活率及成骨活性。显示藻酸盐微粒能为ATSCs增殖提供三维结构基质，有望成为骨组织工程中可注射载体。
李光辉等〔12〕将体外培养的骨髓MSCs与藻酸盐凝胶复合经皮注射骨缺损处发现较单纯细胞悬液有明显促进骨缺损修复的作用。以上说明该材料的存在，给间充质干细胞的生长增殖及代谢创造了一个良好的微环境，而单纯细胞悬液注射侧不仅没有一个良好的细胞生长代谢的微环境，且缺乏细胞运载体，存在细胞丢失的问题，必将导致细胞量的不足，影响了骨的形成。为可注射性组织工程骨研究提供了依据。
但藻酸盐仍存在体内降解过程难以控制、组成成分不稳定等缺点，且有文献报道在体内由于淋巴细胞和炎症细胞的刺激和诱导可发生免疫性损伤〔13〕。
3 胶原（collagen）
胶原为纤维的组成部分，是细胞外基质（ECM）的重要成分。可用于骨软骨细胞的培养基质。具有适宜的微孔径，而且其分布量大，这些特点赋予材料较好的渗透性，适于营养物质、生物因子扩散及血管长入。
Takamine等〔14〕将成骨细胞混于胶原中，经皮注射于四肢骨牵张后间隙，已被证实推动骨痂形成，加速骨形成。AndereyaS等〔15〕在2006年5月首次临床报道22例自体软骨细胞复合I型胶原治疗膝关节局灶性软骨缺损，随访2年取得较好的临床效果。但需更多的病例收集和长期追踪。
4 聚氧乙烯类
聚氧化乙烯类是具有良好生物相容性的高分子材料，可溶于水，随浓度的增大其黏度也相应增大。在温度改变的条件下固化为水凝胶。它与蛋白质和大部分生物大分子不发生作用，几乎可认为无免疫原性。在一定时间内具有可注射性，注入体内后可固化成型。聚合物在体内6～8周由周围组织吸收后经肾脏排泄。
Sims CD等〔16〕将软骨细胞接种于聚氧化乙烯中形成软骨细胞-聚合复合物，注射到裸鼠皮下培养6～12周形成新的软骨。随后陈富林等〔17〕通过注射方式将聚氧化乙烯水凝胶－骨细胞复合物注入裸鼠体内，经人体标本检查和组织学观察证实，成功地再造出骨组织。商品化的Pluronic是德国巴斯夫公司注册商标，是聚氧化乙烯与丙烯的复合物。
但该类凝胶在常温下可溶于水，从而无法作任何体外的组织培养实验；材料降解时间无法在较大范围内调节，难以适应在不同动物对象及不同组织上应用。
5 纤维蛋白凝胶（fibrin glue）
纤维蛋白是血液在正常状态下凝固的终产物。其单体在凝血酶作用下聚合成具有可塑形、可黏附性、可降解性及生物相容性的立体网状结构，还可调节从液态转变为凝胶的时间〔18〕。聚合时能释放一些因子，进一步促进细胞增殖、黏附和基质分泌。很多学者将其作为实验和临床上种子细胞的基质材料，表明纤维蛋白的存在能够吸引宿主MSCs向缺损区迁移，并促进增殖和分化；并为未分化的MSCs迁入和新生血管的长入提供了良好支架，增加了生长因子和靶细胞的作用面积。源于自身的纤维蛋白凝胶，避免了免疫原性问题，可直接用于临床，具有取材简单、制备方便、韧性好等优点，有巨大的应用潜力〔19〕。
陈克明等〔20〕用兔自体骨髓分离和培养MSCs，扩增后与同种异体纤维蛋白复合在一起，植入股骨关节面上5 mm×10 mm的骨软骨缺损区，对侧缺损区只植入单纯纤维蛋白或留作空白对照。术后12周结果示植入复合物的缺损区再生出典型的透明软骨样结构。对侧缺损区表面仅为纤维组织。Ge W〔21〕利用人MSCs诱导分化后与纤维蛋白黏合剂复合注入裸鼠背部，单独纤维蛋白黏合剂和MSCs作为对照组。6～12周处死后组织学和免疫组化观察实验组有软骨组织形成，而对照组无软骨样组织形成，研究认为MSCs与纤维蛋白复合可运用在可注射软骨组织工程。崔庚〔22〕也证实纤维蛋白可制成注射性组织工程复合物修复骨缺损。
6 脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）
将异种骨进行酸处理，脱去矿物质后留有非胶原蛋白、骨生长因子及胶原的复合物，即成为DBM。它可以制成粉末、颗粒、小块或凝胶等多种形式，均易于塑型。DBM也是一种良好MSCs载体，具有一定的骨引导效能及轻度的骨诱导作用。Wilkins等〔23〕用DBM粉末与骨髓混合经皮穿刺治疗69例骨不连病例,61例痊愈，平均在8.1个月。但该材料难溶于水，注射不便。且保留了骨中的生物活性蛋白成分,DBM仍然有一定的抗原性。
7 羟基磷灰石（hydroxyapatite granules calcified,HA）、三磷酸钙类
HA微粒作为可注射骨组织工程载体的适合性在体内外作了较多的评估性研究。Weissenboeck M〔24〕比较了从红藻中制取的钙化HA微粒大小（分别为10～100 μm，200～500 μm and 600～1 000 μm）在体外对MSCs成骨潜能的影响。结果显示HA微粒大小影响MSCs的成骨潜能，微粒大小在碱性磷酸酶活性和I型胶原的产生有不同的影响。Fischer EM〔25〕在体外用羊骨髓MSCs种植培养在大小分别为212～300 μm、500～706 μm的HA上1周，经皮植入裸鼠4周后发现直径在212～300 μm范围内HA植入区有大量骨形成，且在样本的微孔里有骨髓呈现。而直径在500～706 μm范围内HA植入区无骨形成和骨髓出现。提示HA微粒的大小与微孔隙影响细胞的成骨性，提示200～300 μm大小的HA可被用于可注射组织工程骨的载体成分。
8 几丁质（chitin）及其衍生物
几丁质，是一种广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳及真菌细胞壁中的天然多糖。经脱乙酰化反应变成壳聚糖（chitosan）。Hoemann CD等〔26〕将壳聚糖凝胶软骨细胞复合注射入兔软骨缺损处，术后观察有明显修复作用。作者认为此特性通过关节镜注入体内在辅助修复软骨方面有很大的应用前景。
9 其他
文献报道还有琼脂糖凝胶（agarosegel）、聚丙烯延胡索酸酯（PPF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乳酸（PLA）、聚酯类（聚羟基丁酸酯、聚氨基甲酸酯、聚反丁烯二酸酯）等材料，但报道相对较少，需进一步探讨。
10 问题与展望
从现有可注射支架材料的特点及其实际应用情况来看，还面临一些亟待解决的问题：（1）这类材料绝大部分仍处于试验阶段，运用于临床的报道仍为少数；（2）材料缺乏机械强度，大量获取困难、降解时间难以控制等缺点；（3）在体内降解过程和成骨的形成是否适应，不均匀吸收和残留问题及注射载体的时间、频率、最适细胞浓度等，仍有待进一步研究和解决；（4）有些材料的质量直接影响骨组织的形成，需要在材料成分及细胞研究方面分析确认；（5）一些非自体材料多存有免疫原性，可能激发宿主的免疫反应，影响骨软骨的再生。相信随着新的可注射性载体深入研究和材料之间的互相联合应用，理想的可选择的支架材料必将广泛应用于骨软骨组织缺损修复或辅助修复。
作者单位：解放军昆明总医院骨科全军骨科中心，昆明 650032