嗅鞘细胞与中枢神经损伤修复

【关键词】  嗅鞘细胞与中枢神经损伤

　　中枢神经损伤特别是脊髓损伤的修复，至今仍然是医学界的一个难题。其原因是中枢神经的再生能力低下及外在环境对轴突再生的抑制作用。国内外已进行了大量的实验来研究中枢神经损伤的修复问题。这些研究主要从以下方面入手：拮抗神经生长的抑制性环境；刺激轴突再生；细胞移植。用来移植的细胞类型有：胶质细胞包括雪旺细胞、少突神经胶质细胞或其前体细胞、嗅鞘细胞；神经干细胞；胚胎组织；基因修饰的成纤维细胞。其中，嗅鞘细胞移植被认为是一种最有前景的手段，引起了学者们的广泛兴趣，进行了大量的实验研究并取得了显著成果，并在早期临床试验［1～3］中取得了一定的成功。但随着研究的深入，已有学者提出嗅鞘细胞移植后中枢神经损伤修复失败的证据。这是对嗅鞘细胞能够促进轴突再生和功能恢复这一普遍接受的观念的极大挑战。本文重点将近几年来嗅鞘细胞移植修复中枢神经损伤的实验研究作一综述。

　　1  嗅鞘细胞的功能
   
　　嗅鞘细胞位于嗅觉系统，终生具有支持神经发生的功能。在嗅神经损伤后或在正常的细胞更新过程中，新生的嗅神经元由嗅上皮的基底干细胞产生，其轴突延伸通过筛板进入嗅球并与嗅球小球层的二级神经元建立突触联系。这种周围神经的轴突能进入中枢神经系统并形成突触联系的情况是很少见的，而这种独特的现象与嗅鞘细胞的特殊功能有关［4］。
       
　　嗅鞘细胞能分泌多种细胞因子，包括：细胞黏附分子L1和ENCAM、神经营养因子如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素3(NT3)、神经营养素4／5(NT4／5)、神经肽Y、血小板源性生长因子(PDGF)等。这些因子不仅能够促进轴突再生，而且还能为损伤的宿主细胞提供营养支持。嗅鞘细胞还能分泌促进轴突生长的细胞外基质成分如：层黏连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原等，特别是层黏连蛋白，被认为是嗅神经轴突延伸生长的最优底物。此外，嗅鞘细胞还能表达与新生血管发生有关的结缔组织生长因子(CTGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，而新生血管形成被认为有助于神经修复。嗅鞘细胞还可以表达某些与髓鞘形成相关的蛋白，但依赖于培养的条件和嗅鞘细胞所处的发育阶段［5］。
       
　　嗅鞘细胞具有免疫功能。早就有证据表明，嗅鞘细胞具有吞噬轴突碎片的功能。近来对嗅球来源的嗅鞘细胞的吞噬活动的研究发现，嗅鞘细胞之所以对ENCAM和O4具有免疫反应性，实际上是由于嗅鞘细胞吞噬了E-NCAM和04阳性的轴突碎片造成的［6］。嗅鞘细胞能够防止被金黄色葡萄球菌和大肠杆菌污染的培养基出现浑浊，说明嗅鞘细胞具有抗菌作用，而这种抗菌作用与嗅鞘细胞的吞噬功能有关。肺炎球菌感染能通过嗅神经从嗅上皮扩散到嗅球，但这种途径可以被一个目前尚不清楚的机制所限制，而嗅鞘细胞可能在这一机制中起着神经保护的作用。一旦嗅鞘细胞被证实具有这种神经保护功能，那么将来就有可能通过鼻内给予某种药物或基因激活它们，从而防止人们罹患脑炎或脑膜炎［7］。

　　2  嗅鞘细胞促进中枢神经修复的机制
       
　　尽管已有大量实验证实嗅鞘细胞能促进中枢神经再生，但介导这一过程的确切机制仍不明确。在体外，嗅鞘细胞可提供能促进神经元出芽的可溶性的和接触性的信号，如细胞因子BDNF、NT-3、NT-4／5。当嗅鞘细胞直接与损伤的神经元接触时，轴突出芽最多。如果嗅鞘细胞和损伤的神经元分隔开来，但共用同一培养基时，轴突出芽减少但并未完全消失。这一结果表明，嗅鞘细胞诱导的轴突再生可能与其分泌的可溶性的因子和嗅鞘细胞膜直接与损伤轴突细胞膜间的相互作用有关。Deumens等［8］认为这些因子和接触介导机制都参与了嗅鞘细胞刺激轴突生长的过程。但这个过程的效率似乎与移植方式有关。当嗅鞘细胞以多孔的生物材料为载体移植到脊髓时，皮质脊髓束轴突的出芽非常明显，而直接注射移植则不能达到相同的效果［9］。   
       
　　在嗅鞘细胞与视神经节细胞共培养的研究中，利用低亲和力神经生长因子受体(P75)免疫吸附法筛选出来的P75阳性的嗅鞘细胞比来自相同组织的P75阴性的嗅鞘细胞或这2种细胞的混合物更能有效地促进轴突的生长。P75阳性的嗅鞘细胞无论是来源于中枢神经系统的嗅球嗅神经层，还是来源于周围神经系统的嗅神经根，在促进轴突生长方面没有显著性差异［10］。这说明嗅鞘细胞表达的P75与促进轴突生长有关，但其确切功能尚需进一步研究。
       
　　Li等［11］认为，成年中枢神经轴突损伤修复困难，最根本的问题并不在于神经纤维本身而是在于丧失了星形胶质细胞通道。中枢神经损伤后会在损伤部位形成以星形胶质细胞为主要成分的胶质瘢痕。星形胶质细胞胞突一旦与嗅鞘细胞相遇，其结构将发生改变，在损伤部位中形成一个通道，以便再生的轴突通过，从而进一步产生功能性连接。嗅鞘细胞移植正是通过建立这一通道而发挥修复效应。然而，打开这一通道的分子信号机制仍不清楚。
       
　　嗅鞘细胞与其他胶质细胞的相互作用似乎有助于脊髓损伤修复。Li等［12］将嗅鞘细胞移植到背根神经入口区(DREZ)的损伤部位中，大约有10％断裂的纤维获得再生。他认为嗅鞘细胞与宿主背根中的星形胶质细胞、雪旺细胞相互作用后，形成一个“梯样”结构是内生的神经纤维穿越抑制性的周围-中枢界面的关键因素。
       
　　嗅鞘细胞的免疫功能可能对中枢神经损伤的修复有重要意义。中枢神经损伤后常伴有明显的炎症反应，造成二次损伤导致神经元丢失。嗅鞘细胞可能通过调节神经炎症反应来促进神经再生［7］。在与甲基强的松龙联合应用于脊髓损伤修复的研究中，嗅鞘细胞也表现出显著的协同效应。嗅鞘细胞还可能对某些免疫因子如：白介素－6，产生免疫应答反应［13］。白介素－6与启动能使嗅鞘细胞产生促进轴突再生的细胞外基质的细胞内信号转导途径有关。因此，当嗅鞘细胞移植治疗中枢神经急性损伤时，其免疫功能可能对脊髓损伤后的功能恢复有重要意义。
       
　　Barnett等［4］认为嗅鞘细胞即使不通过受损神经通路的再连接，也可以带来功能改善。(1)对于脊髓部分横断伤的模型，代偿性重塑如轴突出芽可以通过旁路途径发生；(2)无论是脊髓不完全损伤还是完全横断伤，再生的下行传导纤维可在非突触部位释放单胺，从而影响反射通路的应激性或增强运动神经元的冲动发放；(3)移植的嗅鞘细胞可能改善损伤部位的环境，有助于保留邻近组织中残留神经纤维的功能和活力；它们还能释放营养物质，减少抑制性因素的产生和受损轴突的再髓鞘化。已有研究表明在没有轴突再生的情况下，大鼠出现了行为学上的改善，说明脊髓损伤后这种机制的确可能存在。
   
　　3  嗅鞘细胞移植与中枢神经修复结果
       
　　鉴于已有大量研究表明嗅鞘细胞移植在中枢神经损伤修复方面具有独特的作用，人们普遍认为嗅鞘细胞能够促进轴突再生和功能恢复，世界上一些地区甚至已经开始了嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的临床试验［1～3］。但近来一些实验研究对嗅鞘细胞的神经修复作用提出了质疑。
       
　　嗅鞘细胞促进中枢神经修复的最早证据之一来自于DREZ损伤的实验研究。DREZ位于背根神经与脊髓的连接处，通常情况下DREZ是背根神经再生进入发育后的中枢神经系统的抑制性区域，但当嗅鞘细胞移植到DREZ后，横断的背根神经能够再生进入脊髓。Navarro等［14］发现在背根神经横断后，嗅鞘细胞移植能诱导再生的传入神经纤维进入脊髓并且与脊髓神经元重建功能性连接，恢复脊髓的反射功能，并能直接观察到冲动传导通过背根神经横断区。Barnett等［14］试图重复这个结果但没有成功，他们没有找到功能性纤维生长和再连接的电生理和解剖学证据。Gomez等［15］也证实与对照组相比，背根神经切断后再吻合并移植嗅鞘细胞没有增加进入脊髓的神经纤维数量，电生理分析也没有显示出再生纤维与脊髓神经元的功能性连接的征象。
   
　　在脊髓挫伤、脊髓碾压伤、 电损伤、光化学损伤、完全横断伤等多种脊髓损伤模型中，嗅鞘细胞的修复作用已被证实［16］。此外，大鼠、狗、猪、人类来源的嗅鞘细胞移植到大鼠脱髓鞘损伤的脊髓、猪的嗅鞘细胞移植到非人类的灵长类动物脱髓鞘损伤的部位，都能促进轴突的再髓鞘化和恢复冲动传导［7］。嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤修复不仅有解剖学恢复的证据，而且还有功能恢复的证据。实验证明，嗅鞘细胞移植后，颈脊髓半横断伤的大鼠恢复了呼吸和爬行功能，完全横断脊髓的成年大鼠恢复了爬行功能和感觉反射。然而，目前已有研究表明嗅鞘细胞移植到脊髓损伤部位并没有增进行为学的康复或只产生极少量的再生或没有再生［17，18］。在皮质脊髓束慢性损伤的研究中，KeyvanFouladi等［19］和Deumens等［20］同样使用嗅鞘细胞联合嗅神经成纤维细胞移植，但前者获得成功，而后者没有。最有趣的是来自Steward等的研究［21］。之前，Lu等［22］将含有嗅鞘细胞的嗅黏膜固有层移植到完全横断伤的胸髓，大鼠获得明显运动功能恢复。为了验证这个实验结果的可重复性，Steward等几乎完全重复了Lu等的实验，但没有发现功能恢复的迹象。
   
　　4  嗅鞘细胞移植出现矛盾结果的原因
       
　　比较这些出现矛盾结果的研究是非常困难的，因为这些研究的实验参数各不相同，如纯化方法、细胞供体的年龄、种属来源、移植细胞的纯度和组成类型、功能恢复的评估手段、移植的方式及移植时间、神经损伤类型等。
      
　　据Boyd等［5］分析，Plant等［17］没有获得成功的其中一个原因在于纯化手段。Plant等纯化嗅鞘细胞的手段是基于嗅鞘细胞表达P75。已有研究报道嗅球的嗅神经层可以分离出P75阳性和阴性2种亚型的嗅鞘细胞。因此，Plant等使用抗P75免疫吸附法纯化只能选择出P75阳性的亚型，而这种亚型可能没有形成髓鞘的能力。另一个可能的原因是嗅鞘细胞供体的年龄。尽管胚胎来源的嗅鞘细胞与背根神经节神经元共培养时，可在超微水平上观察到明显的髓鞘形成，但成年来源的嗅鞘细胞却没有类似的效应。造成这种差别的原因可能是，胚胎来源的嗅鞘细胞具有更强的可塑性，一旦周围微环境中出现恰当的信号，它便维持促进形成髓鞘的能力。
       
　　在移植研究中，嗅鞘细胞移植物的纯度和组成类型并不统一。传统认为纯化的嗅鞘细胞比未经纯化的嗅鞘细胞在促进神经生长方面更有优势，但Raisman等［23］则认为混有其他类型细胞的嗅鞘细胞修复效果更好。因此，嗅鞘细胞移植物的最佳组成仍然存在争论。尽管污染细胞对嗅鞘细胞移植的效果还不是很清楚，但已有研究表明当脑膜细胞混在嗅鞘细胞移植物中时，轴突再髓鞘化更加完全［24］，移植物中成纤维样细胞是脊髓损伤获得再生和功能改善的非常重要的成分［23］。
       
　　神经修复的评估手段在这些研究中也不一致。选择评估手段的主要目的关键在于区分自主性的修复和移植诱导的修复。然而，至今为止仍然没有一个共识。美国国立神经病及中风研究所规定，脊髓损伤功能性再生的确定应通过组织学和电生理学方法证实：轴突再生通过损伤部位并且接合后的再生轴突能对刺激产生反应，而且功能性恢复应源于新的神经连接［16］。但是在实验中，神经功能恢复的组织学和电生理学评估结果与行为学评估结果可能并不相关，而行为学评估是许多成功实验的评估基础［25］。有的学者通过爬行试验来评估后肢功能恢复，然而LopezVales等［16］认为爬行试验并不可靠，因为对照组的动物可能因为脊髓反射而不是随意运动，也能获得较高的评分。此外，功能性恢复是否源于通过损伤部位的再生轴突或损伤部位远侧脊髓通路的改变，仍然需要进一步研究来澄清，因为嗅鞘细胞可以通过其他机制带来功能改善，这种机制不需要受损神经通路的再连接［4］。
       
　　尽管细胞注射的移植方式被很多研究所采用，但一些研究者提出，以这种方式进行嗅鞘细胞移植会导致脊髓组织的进一步损伤，从而阻碍轴突修复并且干扰嗅鞘细胞与星形胶质细胞的最佳相互作用［12］。再者，细胞注射移植也不是在损伤部位形成持续桥接的最佳选择，并且可能也不是在关键性的中枢－周围界面使嗅鞘细胞高密度分布的最有效的方式。Li等［12］认为利用内源性基质承载嗅鞘细胞并用纤维蛋白胶使之稳定的方式进行移植能为神经修复提供一个最佳环境。
       
　　脊髓损伤后何时进行干预也是研究者面临的一个有争议的问题。大多数成功的实验都是在损伤后3 d内甚至在更早的时间进行的，主要原因是急性期干预可以有机会防止炎症反应2次损伤造成的细胞坏死。但急性脊髓损伤可能对某些干预手段特别是细胞移植带来非常有害的环境，当推迟1～2周后进行细胞移植效果会显著增加［19］。而LopezVales等［16］在脊髓横断伤的移植研究中证实急性期移植优于延迟移植，并且推测移植效果可能取决于脊髓损伤的类别、严重程度、干预时间、移植细胞的类别和纯度、细胞数量、移植的准确部位。
       
　　在皮质脊髓束慢性损伤的研究中，Deumens等［20］采用嗅鞘细胞－嗅神经成纤维细胞－生物基质复合体移植，他们没有发现皮质脊髓束轴突再生通过损伤部位及功能改善。他们比较了与之相似但获得成功的研究［19］认为，2个实验中脊髓损伤的平面、范围大小、嗅鞘细胞在损伤部位的存活和迁移情况及移植时间的差异可能是产生相反结果的原因。Steward等［21］指出尽管与Lu等［22］的实验参数非常接近，但仍存在细节上的差别如：模型动物的种属来源、嗅黏膜固有层移植时的放置方向、膀胱挤压和BBB评分的间隔时间，这些因素也可能成为功能恢复失败的原因。
   
　　5  结语
       
　　尽管嗅鞘细胞的功能及其修复神经损伤的机制仍需进一步阐明，而且其修复效果可能受到多种因素的影响，但它对于移植修复中枢神经损伤，仍不失为一种最有希望的候选细胞。深入研究这些问题，将有助于找到合理的策略，使嗅鞘细胞发挥最大的修复效果，并揭示最有可能从嗅鞘细胞移植中受益的中枢神经损伤病人的类型。无论最终结果如何，继续研究嗅鞘细胞生物学特性和移植后的生物学行为，都将增进对中枢神经损伤的理解，并且有助于找到最终攻克中枢神经损伤的方法。
   

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作者单位：东南大学临床医学院， 南京市丁家桥87号求恩二舍103室 210009；东南大学附属中大医院骨科，南京 210009