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【摘要】 目的］用TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的演变情况。［方法］56只健康成年新西兰大白兔，随机分高、低能量两组，每组28只，随机选取一侧后肢为实验组，另一侧为对照组；不同重量的击锤撞击股骨内侧髁软骨面致不同的损伤。术后4 d，1、2、4、8、16、32周收集标本，每个时间组4只兔子，进行TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。［结果］对照组标本中在软骨的中间层和钙化层，出现凋亡细胞。低能量组中，伤后4 d，1、2周的标本中，软骨的移形层和过渡层出现凋亡细胞，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义；4周后的标本中凋亡细胞明显减少，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义。高能量组中，伤后4 d软骨浅表层和移形层中出现凋亡细胞，而且伤后时间越长凋亡细胞所占比率越大，细胞凋亡率与对照组之间有统计学意义。［结论］软骨高、低能量撞击伤后早期软骨细胞均出现凋亡，凋亡率高于对照组；但低能量伤后4周软骨细胞凋亡率恢复到对照组水平；高能量伤后软骨细胞凋亡率随时间逐渐增高。
【关键词】 软骨损伤； 软骨细胞； 凋亡； 创伤性骨关节炎
近来的研究表明，骨关节炎和体外软骨损伤模型中，可观察到软骨细胞的凋亡。随着骨关节炎严重程度加重，软骨细胞的凋亡率也随之增加，机械损伤也能诱导软骨细胞的凋亡，后者可能是软骨细胞对机械损伤的最早反应之一［1,2］。体内关节软骨受到撞击伤后，软骨细胞的凋亡率如何演变人们还缺乏足够的认识。本实验在Newberry、Vrahas模型的基础上，建立兔股骨内侧髁软骨损伤不同的模型，用TUNEL标记法和透射电镜观察软骨损伤后软骨细胞凋亡的演变情况。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
56只健康成年新西兰大白兔，雌雄不限，体重3.0～3.5 kg，随机分为轻、重2组，每组28只，随机选取一侧后肢为实验组，另一侧为对照组。再随机分为术后4 d，1、2、4、8、16、32周7个时间组，每组4只动物。
1.2 关节软骨损伤模型的建立
1.2.1 5％水合氯醛1.25 ml／kg腹腔注射麻醉，取仰卧位，脱毛，常规消毒铺巾。
1.2.2 膝关节内侧纵形切口，长3 cm，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜、关节囊，将髌骨外翻，膝关节屈曲120°，使股骨干与水平面垂直，骨盆固定带固定骨盆，用大腿固定带固定大腿防止撞击时不稳定。
1.2.3 用1.33、0.43 kg的击锤分别于46、20 cm高处通过导杆自由坠落，产生的能量为6.3 J(能造成胶原网架断裂)和0.9 J(不能造成胶原网架断裂)［2、3］，再通过撞击体致股骨内侧髁软骨面的损伤。对照侧不行撞击，余步骤同试验组。术毕庆大霉素生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合伤口。麻醉清醒后笼内自由活动。术后肌注青霉素20万单位，每日2次，连用3 d。
(4)于术后4 d，1、2、4、8、16、32周收集标本，进行TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。
1.3 形态学观察
1.3.1 取材、固定
各组于观察期满后，在相同位置用锋利双面刀片软骨下骨处切取0.5 cm×0.4 cm×0.2 cm的软骨，不取软骨下骨，避免了因标本脱钙过程中破坏细胞造成假阳性。标本切成2等份，1份立即置于10％中性福尔马林溶液中在室温下固定24h后，石蜡包埋组织块，作连续切片，片厚为51 μm，制成病理切片备用。另1份备做透射电镜之用。
1.3.2 TUNEL末端标记
病理切片常规脱蜡，梯度酒精补水后，切片滴加蛋白酶K修复抗原。滴加20％小牛血清和3％小牛血清白蛋白封闭非特异性反应。在DNA片段标记后，用0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温，15 min。切片滴加20％羊血清、3％小牛血清白蛋白及1％封阻剂，37℃，15 min，再次封闭非特异性反应。切片滴加1∶2稀释的POD 20 μl，置湿盒内，37℃，30 min进行免疫反应，扩大信号。镜控下，DABH2O2显色。胞核呈深棕色即用自来水流水冲洗终断反应。苏木精复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
1.3.3 透射电镜
将标本放入5％戊二醛保存液中浸润保护，用锋利的双面刀片冠状面将软骨切成1 mm3小块，立即投入4℃ 5％戊二醛溶液中固定24 h后，0.1 mol／L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.35)漂洗24 h。1％锇酸后固定2 h，乙醇逐级脱水后环氧树脂包埋，超薄切片机70 nm超薄切片，经醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，HITACHI600透射电镜观察，拍片。
1.4 图像分析
每1张TUNEL标记切片显微摄像镜下(放大10×40)，随机选取4处视野，将图像捕获入计算机，形成后缀名为JPEG的彩色数码图像。在MIOS2000图像分析仪内做图像分析，采用目标计数，测定软骨细胞凋亡率，算术平均后得到每张切片的细胞凋亡率。
1.5 统计学处理
用SPSS 12.0统计软件包，按高、低能量组与相应对照组分别进行两两比较，采用t检验，取95％可信区间，观察各实验组与对照组的软骨细胞凋亡率有无统计学差异。
2 结果
术后所有实验动物均存活至预定取材时间，切口愈合好，无1例感染。
2.1 TUNEL标记法软骨细胞凋亡率的观测
软骨细胞核呈橙黄色的为凋亡细胞，蓝色的为正常细胞。对照组标本中在软骨的中间层和钙化层，出现凋亡细胞。低能量组中，伤后4 d，1、2周的标本中，软骨的移形层和过渡层出现凋亡细胞，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义;4周后的标本中凋亡细胞明显减少，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义(P<0.01)(图1、2)。高能量组中，伤后4 d软骨浅表层和移形层中出现凋亡细胞，且伤后时间越长凋亡细胞所占比率越大，细胞凋亡率与对照组之间有统计学意义(图3、4)。
2.2 透射电镜
高、低能量撞击组软骨细胞凋亡的特征性表现为：细胞偏离胞周基质，胞浆内空泡形成，细胞器减少，残存粗面内质网扩张，核膜不规则，核固缩或细胞碎裂，染色质浓缩、边聚(图5)。对照组的胞周基质清晰浓密，细胞位于陷窝内，软骨细胞胞膜及核膜完整，胞浆内细胞器明晰可见，胞周基质清晰浓密，内质网、线粒体和高尔基体等细胞器丰富(图6)。
3 讨论
在正常关节软骨中，1％软骨细胞可见凋亡征象，凋亡主要发生于软骨肥大层，随着年龄的增加，软骨细胞凋亡率也逐步增加。骨关节炎中可见50％的软骨细胞凋亡，可发生于软骨全层。软骨细胞的异常死亡势必影响软骨分解及合成代谢的动态平衡，可见，软骨细胞异常凋亡参与了骨关节炎的病理过程。
机械损伤能够引起软骨细胞的死亡，但是死亡形式是通过凋亡或是坏死还有待进一步证实。Tew等［3］用环钻造成软骨损伤后，光学显微镜、透射电镜和TUNEL法观察软骨细胞的死亡形式，在伤口的边缘出现软骨细胞凋亡，表现为细胞核浓缩和固缩，胞浆萎缩，细胞偏离胞周基质，这与本研究中观察到的软骨细胞凋亡情况相一致。Loening等［4］在体外用2～30 MPa压力撞击牛的软骨，采用TUNEL法观察软骨细胞的凋亡，发现在中度撞击会导致软骨细胞凋亡的明显增加，软骨在撞击伤后，出现其它变化时，凋亡是最早出现的反应形式之一。D′Lima等［5］在体外将机械力加载到培养牛的关节软骨细胞上，发现软骨细胞凋亡率随加载力的增加而增加。进一步通过电镜和原位末端DNA片段标记技术证实，培养牛的软骨细胞受到创伤后，邻近损伤处的软骨细胞凋亡率也明显增加。
本研究分别用6.3、0.9 J不同能量撞击兔股骨内侧髁造成软骨不同的损伤，伤后4 d，1、2、4、8、16、32周取标本，TUNEL法和透射电镜法来观测软骨细胞的凋亡，有其特异性和敏感性。结果表明，关节软骨被撞击后软骨细胞均出现凋亡，凋亡的软骨细胞以浅表层和中间层较多，高能量伤后软骨细胞的凋亡率明显较低能量组高，伤后时间越长，细胞凋亡现象越重。而低能量伤后4 d也出现凋亡，4周后细胞凋亡现象不再明显。由此作者认为，高能量伤不但造成细胞损伤，而且软骨有裂隙，胶原纤维网架断裂，完好的软骨细胞不能修复此类损伤，结果造成软骨细胞受到长期反复的慢性损伤，导致凋亡进一步加重，这样使胶原纤维网架遭到进一步损伤，形成恶性循环，以致凋亡程度随伤后时间延长而加重。低能量伤开始出现的凋亡表明在撞击时直接使软骨细胞受到损伤，但由于胶原纤维没有断裂，使软骨细胞免遭进一步损伤，才出现其损伤后4周软骨细胞凋亡率与对照组的差异无统计学意义。
通过本研究表明，软骨的损伤中，软骨细胞的凋亡可能是促使软骨退变的重要因素之一，但胶原纤维网架是否完整也许对软骨的持续损伤更重要。
(本文附图见加页2)（略）
【参考文献】
［1］ Costouros JG,Dang AC,Kim HT. Comparison of chondrocyte apoptosis in vivo and in vitro following actue osteochondral injury［J］.J Orthop Res,2004,22:678-683.
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［5］ D'Lima D,Hashimoto S,Chen PC,et al.Cartilage injury induces chondrocyte apoptosis［J］.J Bone Joint Surg（Am），2001，83(2): 19-21.
作者单位：江苏大学附属医院骨科，镇江 212000；四川大学华西医院骨科，成都 610041