周围神经联合活化巨噬细胞移植修复小鼠脊髓损伤

【摘要】  目的］探讨周围神经联合活化巨噬细胞联合移植修复小鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的效果。［方法］首先获取活化巨噬细胞及周围神经备用，将所有实验用小鼠均制成脊髓半切模型，最后获得符合实验要求的小鼠共81只。将其随机分为4组，A组20只，为巨噬细胞移植组；B组20只，为周围神经移植组；C组21只为周围神经与巨噬细胞联合移植组；D组20只，为空白对照组。每一组内再随机分为3组，第1组7只，用来观察肢体运动恢复情况及神经电生理变化情况；第2组7只小鼠，用来进行脊髓组织切片免疫组化检查；第3组6只小鼠（C3组7只），作为实验补充组。从术后第1周到术后第12周，通过术后BBB运动功能评分。SEP检测、免疫组化组织学观察来评估SCI的修复情况，采用SPSS 12.0软件包用ONE WAY ANOVA法进行数据处理，组间差异选用q检验进行两两比较，进行统计学处理。［结果］小鼠肢体运动功能评分及SEP检测结果：C1组与其他各组均存在差异（P＜0.01），动物肢体功能恢复显著。A1组和B1组与其他两组存在差异（P＜0.01），两组间相比，B1虽较A1组评分略高，但两者无统计学差异（P＞0.05）。动物肢体功能恢复明显；免疫组化染色结果：C2组NF阳性细胞数目在SCI处的分布与其他三组有显著性差异。NF阳性细胞分布密度明显大于其他三组（P＜0.05）。［结论］周围神经与活化巨噬细胞联合移植能有效促进小鼠脊髓半切损伤的修复。

【关键词】  SCI； 周围神经； 活化巨噬细胞； SCI模型

　　由于中枢神经系统微弱的再生能力，脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后功能恢复困难是困扰临床医生和实验研究人员多年的课题。本研究应用周围神经与活化巨噬细胞联合移植修复小鼠SCI，通过运动功能评分、SEP检测、免疫组化染色组织切片观察等方法，观察其治疗效果。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  动物及试剂
   
　　雄性BALB/C小鼠100只，体重25～30 g，由山东大学医学院实验动物中心SPF级动物实验室提供。BALB/C小鼠为纯系传代繁殖，相互间细胞组织移植无排斥。主要试剂为AntiHuman CD68、AntiHuman GFAP、AntiHuman NF、免疫组化试剂盒（胰酶消化液，DAB显色剂，3%H2O2，福州迈新生物技术开发有限公司）。
   
　　1.2  活化巨噬细胞的获得
   
　　取1只雄性BALB/C小鼠，切取一段脊髓作为脊髓抗原。另取5只BALB/C小鼠，处死后向腹腔注射PBS获取小鼠巨噬细胞。脊髓抗原和巨噬细胞一起培养获得活化巨噬细胞。然后进行细胞计数，调整细胞悬浮液浓度至105/ml。
   
　　1.3  周围神经的制备
   
　　取BALB/C小鼠2只，游离并切除双侧坐骨神经备用。
   
　　1.4  小鼠脊髓半切模型的制备
   
　　暴露BALB/C小鼠的T10椎棘突及椎板，在手术显微镜下仔细将其咬除显露脊髓，在硬脊膜背部中央血管左侧1 mm处用细针头尖切割脊髓左侧半形成长约3 mm的间隙。使左侧脊髓半切（图1）。

　　图1  脊髓半切模型制作过程（略）

　　1.5  最后获得符合实验要求的小鼠共81只
   
　　将其随机分为4组。A组20只小鼠，为巨噬细胞移植组；B组20只小鼠，为周围神经移植组；C组21只小鼠，为周围神经与巨噬细胞联合移植组；D组20只小鼠，为空白对照组。每一组内再随机分为3组，第1组7只小鼠，用来观察肢体运动恢复情况及神经电生理变化情况。第2组7只小鼠，用来进行脊髓组织切片免疫组化检查。第3组6只小鼠（C3组7只），作为实验补充组。
   
　　1.6  周围神经及巨噬细胞的移植
   
　　小鼠脊髓半切模型制备成功后，将坐骨神经制成长约3 mm的神经段后填充于脊髓缺损处，术中应保持神经头尾端与脊髓一致且移植神经同脊髓断端紧密接触。用微量注射器取5 μl活化巨噬细胞悬液，于手术显微镜下注入到脊髓半切的间隙内。
   
　　1.7  实验动物的神经学功能评估及观察方法
   
　　分别对A1、B1和C1组的7只小鼠，从术后第1周到术后第12周，进行每周1次的BBB肢体运动功能评分后，接着进行SEP（体感诱发电位）检查。分析所记录的SEP波形的潜伏期、峰间波幅。
   
　　分别在小鼠行脊髓半切后的第1、4、7 d、第2、4、5、12周分别随机抓取A2、B2、C2、D2组的1只小鼠进行病理标本制备及免疫组化染色。免疫组化染色用AntiHuman CD68标记活性巨噬细胞，用AntiHuman GFAP标记胶质细胞，用AntiHuman NF标记神经元轴突。按试剂盒说明书操作（福州迈新生物技术开发有限公司，二步法免疫组化试剂盒）。
   
　　1.8  细胞及损伤区神经纤维计数
   
　　用PBS代替一抗设立阴性对照，在损伤区利用血球计数板网格（每个网格为1 μm2）连续计数10个相邻区域巨噬细胞、星形胶质细胞或神经元轴突的数目并取其平均值。
   
　　1.9  统计学处理
   
　　采用SPSS 12.0软件包进行ONE WAY ANONA检验，组间差异选q检验进行两两比较，P＜0.05有统计学意义。
   
　　2  结果
   
　　2.1  术后不同时间点实验小鼠肢体运动功能评分情况
   
　　A1、B1、C13组小鼠4周时评分开始升高，C1组动物增高尤其明显。8周后动物评分增高明显较快，至12周动物评分可达10分以上。D1组动物评分增高不明显。
   
　　C1组与其他各组均存在差异（P＜0.01)，肢体功能恢复显著。A1组和B1组与其他两组存在差异（P＜0.01），两组间相比，B1组虽较A1组评分略高，但两者无统计学差异（P＞0.05）。动物肢体功能恢复明显。
   
　　2.2  脊髓半切后小鼠SEP的检测结果（图2）
   
　　A1、B1及C13组小鼠SEP从术后3周时开始出现波形，其后潜伏期逐渐缩短，波幅逐渐增高，至第7～8周时变化明显增快。C1组小鼠变化尤为明显。D1组小鼠自第4周才出现波形，其后潜伏期及波幅没有明显变化。C1组与其他各组均存在差异（P＜0.05），A1组和B1组与其他两组存在差异，但两者无统计学差异（P＞0.05）。
   
　　2.3  脊髓半切后小鼠免疫组化染色结果（图3）
   
　　2.3.1  巨噬细胞在各组小鼠脊髓半切处的表现
   
　　C2、A2组与其他两组之间巨噬细胞在SCI处的分布有显著性差异（P＜0.05） 。C2组与A2组巨噬细胞在SCI处的分布无显著性差异（P＞0.05）。B2组与对照组之间巨噬细胞在SCI处的分布无显著性差异（P＞0.05）。
   
　　2.3.3  神经元轴突在各组小鼠脊髓半切处的表现
   
　　C2组第12周植入的周围神经和脊髓组织相融，大量神经纤维再生，NF阳性细胞分布浓密均匀，密度显著大于其他3组(P＜0.05)。D2组小鼠术后8周时轴突只有短距离，少量生长，再生困难。NF阳性细胞分布密度明显小于其他3组（P＜0.05）(表1)。

　　图2aC1组术后12周SEP波形（略）

　　图2bD1组术后12周SEP波形（略）

　　图3aC2组12周时AntiHuman NF标记神经元轴突的免疫组化染色：NF阳性细胞分布浓密均匀，密度显著大于其他3组（×400）（略）

　　图3bC2组小鼠脊髓半切后12周：植入的周围神经和脊髓组织相融，大量神经纤维再生（HE染色  ×400）（略）
　　
　　表1  各个时相点神经元细胞的免疫组化染色情况（略）

　　3  讨论
   
　　对巨噬细胞在中枢系统中损伤与修复中的作用，文献报道观点并不一致〔1、2〕。在整个机体组织的修复过程中，炎性反应贯穿始终，在炎性细胞中主要是巨噬细胞起作用，它能够清除坏死组织和分泌营养因子，在所有组织修复过程中起着重要的作用〔3〕。Mantovani等〔4〕认为，巨噬细胞受炎性反应中微环境不同的信号影响，可转变为“经典”活化型和“选择”活化型。“经典”活化型巨噬细胞可分泌前炎性细胞因子，对宿主细胞造成进一步的损伤。“选择”活化型巨噬细胞由IL4和糖皮质激素诱导转换而来，可调整免疫炎性反应的过程，清除坏死组织的残片，促进血管再生、组织重建和修复。本实验作者采用终细胞浓度为105/ml的巨噬细胞悬液5 μl，脊髓半切伤后即时注入SCI处，明显减少了SCI后胶质瘢痕的形成，并促进脊髓断端的“出芽作用”，再生轴突可向远侧延长较远的距离。术后免疫组化染色观察见巨噬细胞移植组小鼠GFAP阳性细胞明显少于单纯脊髓半切组，NF染色阳性细胞明显多于对照组。术后运动功能评分及SEP检测均有明显改善。这就证明了Bigini〔5〕巨噬细胞可促进神经轴突再生的观点。单纯脊髓半切组小鼠巨噬细胞数量在第4 d开始上升，到第7 d达到高峰。但却并没有起到促进轴突再生的作用。单纯神经移植组局部巨噬细胞数量明显较少，可能是周围神经含有雪旺氏细胞和神经营养因子，抑制了局部小胶质细胞/巨噬细胞的活性。但动物脊髓功能却有明显的改善。由此作者推断：在SCI处，巨噬细胞的作用是双相性的，过多或过少都可以使巨噬细胞发挥抑制轴突生长的作用，只有在合适的浓度下，巨噬细胞才能发挥“选择”活化型巨噬细胞的作用，促进神经轴突的生长。
   
　　周围神经含有雪旺氏细胞和神经生长因子，可以为脊髓再生提供所需的微环境。雪旺氏细胞被植入中枢神经系统后在促进轴突再生中起关键作用，移植雪旺氏细胞可限制损伤诱导的组织损失，促进轴突再生和髓鞘化〔6〕。雪旺氏细胞能分泌多种神经营养因子和产生细胞外基质，具有保护和营养受损神经元、诱导轴突再生的作用。尤其是在华勒氏变性期，释放的神经生长因子和其他NTF高于正常的10倍。雪旺氏细胞还可以抑制星形胶质细胞、减轻胶质瘢痕、缩小损伤腔，为轴突再生提供良好的局部环境。
   
　　尽管SCI后单纯的周围神经移植或活化巨噬细胞移植均取得了一定疗效。但实验中作者观察到单纯周围神经移植后，神经元轴突能通过脊髓与损伤神经的近端界面，并能在移植神经中延伸一段距离，但常常受阻于远端界面。这与文献报道的情况相吻合。单独应用神经移植修复SCI的效果较差〔7〕。在作者的实验中，周围神经与巨噬细胞联合移植组小鼠术后的组织学观察可以发现，部分再生的神经元轴突不但通过了脊髓与移植神经的近端界面，而且有许多纤维通过远端界面。其纤维数量明显多于单纯周围神经移植组及单纯巨噬细胞移植组。其SEP检测结果及运动功能评分亦明显好于其他3组。这说明应用活化巨噬细胞和周围神经联合移植修复脊髓损伤，可产生明显的协同作用，既减轻了损伤早期的继发性损害，又为断端神经轴突的再生提供营养物质和再生通道，使其更加顺利地长入远端的靶器官。
   

【参考文献】
  　〔1〕 胥少汀，郭世绂.脊髓损伤基础与临床［M］.第2版，北京：人民卫生出版社，2002，205.

　　〔2〕 Bomstein Y,Marder JB,Vitner K,et al.Features of skincoincubated macrophages that promote recovery from spinal cord injury［J］.J Neuroimmunol，142(1、2)：1016.

　　〔3〕 Sicard RE.Differential inflammatory and immunological responses in tissue regeneration and repair［M］.Ann N Y Acad Sci，2002,961：368371.

　　〔4〕 Mantovani A,Sozzani S,Locati M,et al.Macrophage polarization:tumorassociated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes［J］.Trends Immune，2002,23(11)：549560.

　　〔5〕 Bigini P,Bastone A,Mennini T.Glutamato transporters in the spinal cord of the wobbler mouse［J］.Neuroreport,2002,12(9)：1815.

　　〔6〕 巩腾.脊髓损伤后轴突再生修复的研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2005，13(22)：17451747.
　　
　　〔7〕 Tessler A,Fischer I,Giszter S,et al.Embryonic spinal cord transplants enhance locomotor performance in spinaliaed new born rats［J］.Adv Neurol,1997,72：291303.

作者单位：烟台毓璜顶医院骨科，山东 264000