红霉素抑制磨损颗粒诱发体内骨溶解的研究

【摘要】  ［目的］通过小鼠体内磨损颗粒颅骨溶解模型研究红霉素（erythromycin, EM）抑制磨损颗粒诱发骨溶解的效果。［方法］24只8周龄的C57BL/J6雄性小鼠随机分为4组：聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate, PMMA）组接受PMMA 30 mg颗粒植入颅顶部，PMMA+2EM组接受30 mg PMMA颗粒植入加每天EM 2 mg/kg腹腔内注射，PMMA+10EM组接受PMMA 30 mg颗粒植入加每天EM 10 mg/kg腹腔内注射，对照组接受假手术。7 d后取出颅骨进行病理学分析。［结果］颅骨破坏面积对照组为0.079 mm２±0.011 mm２, PMMA组0.335 mm２±0.129 mm２, PMMA+2EM组0.094 mm２±0.019 mm２, PMMA+10EM组0.091 mm２±0.028 mm２。对照组颅骨实验区域内破骨细胞计数为5.3±1.0个,PMMA组为19.2±5.3个, PMMA+2EM组为6.6±1.1个, PMMA+10EM组为6.1±1.9个。与对照组相比，PMMA颗粒可以诱发骨溶解(P<0.001),而EM治疗可以抑制PMMA颗粒诱发的颅骨溶解(P<0.001), 及破骨细胞生成(P<0.001)。［结论］EM可以抑制PMMA磨损颗粒诱发的骨溶解。

【关键词】  磨损颗粒; 无菌性松动; 骨溶解; 红霉素　

　　磨损颗粒导致的骨溶解和无菌性松动是人工关节中晚期失败和翻修手术的常见原因［1，2］。在髋关节置换术后10年，高达20%的患者会产生放射学的松动表现［3］。
   
　　在对人工关节术后磨损颗粒诱发骨溶解松动反应的细胞生物学及分子生物学深入研究的基础上，不少学者进行了许多的努力和尝试如药物治疗或者基因治疗来干预这一过程［4，5］。实验证实基因治疗可以有效的抑制磨损颗粒导致的骨溶解，但由于对其生物安全性的顾虑始终未能解除，近期内难以用于临床。通过药物来治疗磨损颗粒病仍然是研究的热点。
   
　　既往的研究显示红霉素在体外可以通过调节小鼠核因子-κB（nuclear factorkappa B， NFκB）的活性，而有效的抑制磨损颗粒诱导的破骨细胞生成［6］。体内小鼠皮下气囊模型中，红霉素可以抑制超高分子量聚乙烯（ultra high molecular weight polyethylene，UHMWPE）磨损颗粒诱发的炎性骨溶解，抑制了炎性基因如白介素1β（interleukin 1β, IL1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα）的表达，减少了细胞核因子κB受体活化因子（receptor activator of NF kappaB ，RANK）、细胞核因子κB受体活化因子配基（receptor activator of NF kappaB ligand ，RANKL）及蛋白酶K（cathepsin K，CPK）基因的活化［7］。这提示红霉素对于磨损颗粒诱发的骨溶解可能具有治疗价值。本文通过建立小鼠颅骨磨损颗粒骨溶解模型，对红霉素抑制骨溶解的作用进行定量评价［4、5］。
   
　　1  材料和方法

　　1.1  PMMA颗粒准备
   
　　PMMA颗粒由中国科学院物理技术研究所黄勇博士提供，颗粒平均直径<10 μm，99%的颗粒直径在2～3 μm之间。将颗粒浸在无水乙醇中，放到摇床中以200 RPM的速度持续摇48 h，以去除黏附在颗粒上的内毒素和进行消毒。处理好的磨损颗粒悬于无菌的PBS液中。根据商业检测试剂盒(厦门鲎试剂有限公司)检测， PMMA颗粒内毒素含量低于0.1 U/ml。去除内毒素后，PMMA颗粒保存于4℃以备用。

　　1.2  试验设计及动物手术
   
　　24只C57BL/J6雄性小鼠（上海斯莱克动物有限公司）随机分成4组，每组6只，平均体重22±3 g。手术时小鼠用戊巴比妥以45 mg/kg剂量腹腔内麻醉。小鼠头顶部去毛，然后用0.5%的碘伏消毒。经外耳联线中点之间作矢状位切口长约1 cm，暴露直径1 cm的颅骨面积，注意不要破坏骨膜。将悬于100 μl PBS液体中的PMMA颗粒均匀的涂于暴露颅骨的中缝的骨膜外。皮肤行间断缝合，防止颗粒外溢。PMMA组接受了PMMA 30 mg颗粒植入颅骨部位，PMMA+2EM组接受了30 mg PMMA颗粒植入加上每天红霉素2 mg/kg腹腔内注射，PMMA+10EM组接受了PMMA 30 mg颗粒植入加上每天红霉素10 mg/kg腹腔内注射（红霉素购自北京鼎国生物技术有限公司）。对照组接受了手术和植入100 μl的不含PMMA颗粒的PBS液体。手术后，待小鼠清醒后送入笼中。动物自由摄取食物和水，饲养于12 h开关灯的清洁动物房中。

　　1.3  标本处理和组织学分析
   
　　手术后7 d，过量麻醉处死小鼠，取出颅骨，注意不要撕裂颅骨缝。去掉表面的皮肤及颅骨下面的脑组织，标本在4%的多聚四醛中固定12 h，然后在12.5%的EDTA（pH 7.4）4℃脱钙2周。脱钙液每3～4 d更换1次。梯度乙醇中脱水，石蜡包埋。矢状位做7 μm厚的连续切片。对于颅骨骨溶解分析时，每个标本对5张连续切片进行HE染色。照片用Nikon Eclipse 80i显微镜系统于100X条件下拍摄。颅骨实验区位于拍摄的中央。使用Image ProPlus 5.0（Media Cybernetics, USA）软件来计算骨溶解破坏面积(图1a)。
   
　　分析破骨细胞生成时，每个标本的5张连续切片用商业抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acidic phosphatase, TRAP）染色试剂盒（上海仁宝生物技术有限公司）进行染色。在二甲苯中脱蜡后，切片在染色工作液中37℃孵育90 min。流水冲洗后于室温下用1%的甲基绿进行复染色5 min。中性树胶封片。骨溶解区域内红染的细胞为TRAP阳性的破骨细胞（图1b）。

　　1.4  统计分析
   
　　结果表示为均数±标准差。颅骨的骨溶解面积和TRAP阳性破骨细胞在ANOVA分析后进行配对t检验（双侧），P<0.05认为差别有明显统计学意义。
   
　　2  结果

　　2.1  颅骨实验区骨溶解
   
　　对照组颅骨没有明显的骨溶解。植入PMMA颗粒的小鼠，可见明显的颅骨破坏；红霉素治疗的2组小鼠，骨破坏和骨溶解减少（图2）。对照组骨溶解面积为0.079 mm2±0.011 mm2, PMMA组0.335 mm2±0.129 mm2,高于对照组（P<0.001）。在PMMA+2EM组0.094 mm2±0.019mm2, PMMA+10EM组0.091 mm2±0.028mm2，2组骨溶解面积均小于PMMA组（P<0.001）(图3a)。红霉素治疗的2组小鼠，其颅骨溶解面积与对照组相比，均无明显差别（P>0.05）。

　　2.2  破骨细胞数量
   
　　植入颗粒后，在实验区域诱发破骨细胞的生成，给予红霉素治疗后，破骨细胞的生成被抑制了(图2)。对照组破骨细胞为5.3±1.0个,PMMA组为19.2±5.3个, PMMA+2EM组为6.6±1.1个, PMMA+10EM组为6.1±1.9个（图3b）。PMMA颗粒植入组的破骨细胞数多于对照组（P<0.001）；与PMMA组相比，PMMA+2EM及PMMA+10EM治疗组的破骨细胞生成被抑制了（P<0.001）。与对照组相比，红霉素治疗的2组小鼠，实验区域破骨细胞数均无明显差别（P>0.05）。
   
　　3  讨论
   
　　人工关节置换手术因能有效的缓解疼痛和提高关节的功能，已成为治疗严重关节疾病的主要手段。在短期和中期随访中，全关节置换手术的成功率相当高。然后长期随访的结果，髋关节置换手术后10年，有20%的患者有放射学松动的表现［3］，松动可继续发展从而导致人工关节置换手术的失败。人工关节部件磨擦生成的磨损颗粒在局部引起持续的生物反应被认为是导致假体周围骨溶解和假体的无菌性松动的主要原因。
   
　　关节磨损产生的颗粒可以刺激巨噬细胞生成大量的促破骨细胞生成因子如TNFα、IL1β、IL6［8］。磨损颗粒刺激基质细胞和成骨细胞分泌生成单核细胞趋化因子1（monocyte chemoattractant protein1,MCP1）、RANKL，增加RANKL/骨保护素（osteoprotegrin, OPG）比例和上调RANKL表达［9～12］。这有利于诱发破骨细胞的生成，促进假体周围骨溶解吸收，打破正常骨生成和骨吸收之间的平衡。目前已经有研究用药物、基因治疗来抑制磨损颗粒的不良反应，并且取得了一些进展［4,5］。但与临床应用还有很大距离。

　　图1  颅骨骨溶解面积分析（略）   

　　1a.蓝线范围内部位为骨溶解区，所测得的是骨溶解面积  1b.对骨溶解区域内TRAP+染色的细胞计数，如黑色箭头所指(100×) 

　　图2  小鼠颅骨HE及TRAP染色（略）　

　　与对照组相比，PMMA颗粒植入后可以诱发颅骨溶解和破骨细胞数量增加。红霉素治疗可以抑制PMMA颗粒诱发的上述反应,100× 

　　图3  小鼠颅骨中缝骨溶解 （略）  

　　3a.与对照组相比PMMA颗粒可以诱发骨溶解(P<0.001)，红霉素治疗组骨溶解受到抑制(P<0.001)  3b.植入PMMA颗粒后,中缝及临近破骨细胞与对照组相比增加(P<0.001),给予红霉素治疗后,破骨细胞减少(P<0.001)
   
　　以前的研究显示，红霉素可以抑制磨损颗粒诱发的炎性反应［6］。磨损颗粒刺激巨噬细胞可以引起炎性因子的表达并分泌到培养基中，这种含有炎性因子的培养基与新生小鼠颅骨培养，炎性因子可以激活破骨细胞的活性从而引起钙的释放。而给予红霉素治疗可以抑制破骨细胞的活化，从而抑制钙的释放，同时红霉素治疗可以抑制炎性因子的表达分泌。在体外诱导破骨细胞生成时，给予红霉素治疗可以有效的抑制破骨细胞的生成，其机制可能是通过下调NFκB信号通路发挥作用。在小鼠的背部皮下注射无菌空气可以形成一个皮下气囊（air pouch），将磨损颗粒注射到气囊中，可以诱发明显的炎症反应，给予红霉素可以抑制炎症反应和骨溶解［7］。小鼠体内皮下气囊模型能够比较好的反映软组织对于磨损颗粒的反应，比较容易进行炎性细胞因子分析和软组织反应。但是这个模型对于反映骨溶解破坏不容易作定量测定，因为该模型是将一块没有活力的骨植入到皮下气囊内，没有考虑骨自身的修复能力［7］。所以本试验，运用小鼠颅骨溶解模型来定量评价红霉素对磨损颗粒诱发骨溶解吸收的抑制作用。小鼠颅骨溶解的模型中，骨的破坏可以通过分析颅骨中缝及临近骨破坏区域的面积及该区域内TRAP阳性染色的破骨细胞数目来进行分析。因为这个模型简单方便，所以有许多学者采用其来研究磨损颗粒诱发的骨溶解［4，5］。
   
　　本实验结果显示，红霉素能够有效的抑制PMMA颗粒诱发的小鼠颅骨中缝骨溶解吸收。在接受红霉素干预治疗的两组小鼠中，骨溶解吸收面积降低到正常对照组水平，与单纯植入PMMA颗粒小鼠相比，骨溶解被明显抑制了。在破骨细胞生成分析中，与PMMA磨损颗粒组相比较，即使低剂量的红霉素治疗也能有效的抑制磨损颗粒诱发的体内破骨细胞的生成。红霉素可以抑制破骨细胞的生成降低到对照组的水平。
   
　　机体对于磨损颗粒的反应表现为颗粒植入部位明显的骨溶解吸收和破骨细胞生成的增加。全身红霉素给药后可有效的抑制局部磨损颗粒诱发的骨溶解和破骨细胞生成。这意味着红霉素可能用于抑制或治疗人工关节磨损颗粒诱发的骨溶解，防止无菌性松动的发生，从而可以提高关节假体的使用寿命，维持关节置换手术的长期疗效。在可能的临床运用之前，还需要用大动物做进一步验证和较长时间的观察，及证明长期运用小剂量红霉素治疗的生物安全性和有效性。

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作者单位：上海交通大学医学院上海市第九人民医院骨科， 上海市制造局路639号 200011