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【摘要】 ［目的］观察骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）与异体脱抗原松质骨（allogeneic antigenextracted cancellous bone，AACB）复合后修复股骨头坏死（femoral head necrosis，FHN）病灶清除区缺损，评价bFGF对FHN的再血管化作用及其与钙含量的关系。［方法］取18只杂种犬共36侧股骨头，建立液氮冷冻诱导性犬股骨头缺损坏死模型，随机分为A、B、C 3组，每组12侧。A组为空白对照，B组植入AACB／BMP，C组植入AACB/BMP／bFGF。每个股骨头内植入AACB约0.33 g，BMP约12.5 mg，bFGF约2 000 U。术后3、6和12周分批处死动物，每组每次处死2只。行组织学观察，免疫组织化学染色，进行血管计数和血管面积图像分析、钙含量测定、并分析再血管化作用与钙含量间的关系。［结果］组织学观察，12周时A组以纤维结缔组织为主，B组多量新生骨组织形成，密度不均，C组股骨头骨缺损完全修复。血管计数和血管面积，C组术后3周移植物孔隙内大量血管增生，6和12周时血管数量和血管面积进一步增加，各时间点都大于A、B组，具有统计学意义（P＜0.05）。钙含量，C组术后3周钙含量小于B组，12周时大于B组（P＜0.05）。再血管化作用与钙含量的关系，C组与B组比较，术后3周时再血管化与钙含量呈负相关，12周时呈正相关。［结论］AACB是生长因子的良好吸附载体，适宜新生血管长入。吸附有bFGF及BMP的AACB具有较强的再血管化能力，bFGF促进植骨材料吸收，加速新骨形成。这一疗法有望成为FHN治疗的一种手段。
【关键词】 股骨头坏死； 骨形成蛋白； 碱性成纤维细胞生长因子； 异体骨
股骨头坏死（femoral head necrosis,FHN）为临床上常见的骨科疾病，其治疗较棘手。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）是近来研究较多的两种骨生长因子。BMP的高效诱导成骨活性已经被许多实验和临床研究证实〔1〕。bFGF能促进BMP诱导成骨，尤其bFGF是一强大的血管生成因子〔2〕。为此本文通过液氮冷冻法建立犬股骨头缺损坏死模型〔3〕，模拟临床上开窗减压植骨术的治疗过程，以BMP／bFGF／异体脱抗原松质骨（allogeneic antigenextracted cancellous bone，AACB）复合人工骨充填骨腔，以观察bFGF在股骨头内促进BMP诱导成骨及再血管化过程，以及再血管化与钙含量间的关系，初步评价其促进早期FHN愈合的可能作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料
CD34单克隆抗体（迈新试剂公司，上海）；AACB／BMP／bFGF复合人工骨由昆明医学院第一临床学院骨科实验室制备〔4〕。
1.2 动物模型的制作及实验方法
健康成年杂种犬18只，雌雄不限，体重（12.0±1.9）kg（昆明医学院动物实验中心提供）。3％戊巴比妥钠静脉注射麻醉，无菌操作下行双侧髋外侧切口，显露股骨头，按龚跃昆等〔5〕的方法制作股骨头缺损坏死模型。造模后8周，将18只犬36侧股骨头随机分为3组，每组6只12侧。采用造模时同样的手术入路，A组为空白对照，刮除坏死的软骨下骨，直到松质骨红润，形成直径约1.5 cm的骨缺损，不植入任何材料；B组植入AACB／BMP；C组植入AACB／BMP／bFGF。术后3、6和12周分批各处死2只犬取4侧股骨头，进行观察分析。
1.3 观察指标
1.3.1 大体观察
动物处死后，解剖股骨头行剖面大体观察。
1.3.2 组织学观察
股骨头以10％甲醛固定，硝酸脱钙，石蜡包埋，切片后HE染色，光镜观察。
1.3.3 免疫组织化学染色、血管计数和血管面积图像分析
采用CD34单克隆抗体。切片厚4 μm，按常规ABC法进行免疫组织化学染色。阳性为棕黄色，定位于血管内皮细胞胞浆，以已知阳性组织切片为阳性对照。在每张切片的用人工骨修复后原缺损区随机选取3个100倍视野行血管计数。采用HPIAS1 000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测定血管面积，血管面积=血管截面面积／统计场面积×100％。
1.3.4 钙含量测定、血管数和血管面积与钙含量的关系分析
采用XL30扫描电镜能谱分析仪测定缺损区修复后的钙含量。用SPSS 11.5软件分析血管数及血管面积与钙含量的关系。
1.4 统计学处理
用SPSS 11.5统计软件包分析处理所有数据，以均数±标准差表示，采用组间单因素方差分析和相关性分析，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
A组：3和6周缺损清晰可见，12周仍有缺损残存；B组：3周移植物色红润，12周多量新生骨组织形成，密度不均；C组：3周肉芽组织生长活跃，色红润，大量新骨形成，12周与宿主骨颜色及密度一致，界限不清。
2.2 组织学观察
A组：3、6和12周缺损区始终以纤维结缔组织为主。B组：3周纤维组织长入移植物孔隙内，6周移植物大部分吸收，12周移植物完全吸收，多量新生骨组织形成。C组：3周肉芽组织生长活跃，移植物6周完全吸收，大量新骨形成，12周骨改建接近正常，与宿主骨界限不清。
2.3 免疫组织化学
免疫组织化学染色光镜下观察见，A组：术后3、6和12周血管稀疏散在，B组：血管数量少，分布散在，C组：各时间点血管丰富，吻合成网（图1）。
图1术后6周免疫组织化学显示血管化程度（×100）（略）
a.A组血管稀少;b.B组血管数量少，分布散在;c.C组血管丰富，吻合成网
2.4 血管计数
免疫组织化学染色光镜下进行血管计数，经方差分析，在各时点A组血管数少于B组（P＜0.05），A、B组少于C组（P＜0.05）（表1）。
表1 各时点血管计数（略）
*与A组比较，P＜0.05；#与B组比较，P＜0.05。
2.5 血管面积
测定血管面积后经方差分析，在各时点A组血管面积小于B组（P＜0.05），A、B组小于C组（P＜0.05）（表2）。
表2 各时点血管面积比较（略）
*与A组比较，P＜0.05；#与B组比较，P＜0.05。
2.6 钙含量
测定缺损区修复后的钙含量经方差分析，在各时间点A组钙含量小于B组（P＜0.05），A、B组小于C组（P＜0.05）（表3）。
表3 各时点钙含量（略）
*与A组比较，P＜0.05；#与B组比较，P＜0.05。
2.7 血管数与钙含量的关系
B组与C组比较，3周血管数与钙含量呈负相关（P＜0.05）；6周血管数与钙含量呈正相关（P＜0.05）;12周血管数与钙含量呈正相关（P＜0.05）。
2.8 血管面积与钙含量的关系
B组与C组比较，3周血管密度与钙含量呈负相关（P＜0.05）;6周血管密度与钙含量无相关（P＞0.05）；12周血管密度与钙含量呈正相关（P＜0.05）。
3 讨论
至今，仍无一种公认满意的疗法用于治疗成人FHN。骨生长因子能促进骨形成和血管再生，因此即有可能成为改善FHN治疗效果的一个突破口〔5〕。本文采用AACB作为BMP和bFGF的载体，按一定比例制成AACB／BMP／bFGF复合人工骨，并模拟临床开窗减压植骨术治疗FHN的过程，移植修复犬股骨头缺损坏死模型。
按龚跃昆等〔3〕的方法制作股骨头缺损坏死，术后3 d即发生股骨头缺损周围骨坏死，若不植入修复材料，12周仍不能自行愈合（A组，空白对照组），表明此造模方法是可行的。B组修复后12周AACB降解吸收，具有天然松质骨易于降解吸收的优点，但骨组织密度不均，其成骨效能不足以修复股骨头这一特殊部位的缺损坏死。
骨诱导、骨形成是一个由多种生长因子参与并调节的过程〔5〕。BMP对分化成熟的骨和软骨细胞基本无促增殖作用，而bFGF可促进成熟骨和软骨细胞增殖，刺激其他生长因子分泌，而且是一种作用强的血管生长因子〔6〕。实验表明制备的复合人工骨（C组）的成血管性能明显优于A、B组。无论是血管计数还是血管面积，在所有时相上均明显超过A、B组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。通过B、C两组血管数和血管密度与钙含量的关系分析表明，3周时血管数和血管密度与钙含量呈负相关，AACB降解吸收较快；12周时血管数和血管密度与钙含量呈正相关，表明C组新生血管多，新骨形成多，矿化较彻底。bFGF的再血管化作用促进了移植材料的吸收和新骨形成。
该实验结果表明人工骨在修复股骨头坏死时显示出明显的再血管化作用，促进了移植材料的吸收和新骨形成，速度明显快于AACB／BMP组和空白对照组，能够为以缺血为主要矛盾的FHN的修复提供新思路。研究不足：其安全性未得到进一步实验，复合人工骨的生长因子剂量、浓度还有待深入探讨。
【参考文献】
〔1〕 Iwata H,Sakano S,Itoh T,et al.Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery［J］.Clin Orthop Relat Res,2002,（395）:99109.
〔2〕 李晓辉，龚跃昆，宋跃明，等.碱性成纤维细胞生长因子复合部分脱蛋白骨增强兔股骨头骨缺损修复作用的研究［J］.中国修复重建外科杂志，2005，19（3）：183186.
〔3〕 龚跃昆，彭吾训，李世和，等.液氮冷冻建立犬股骨头缺血坏死模型的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2005，13（15）：11711173.
〔4〕 彭吾训，龚跃昆，李世和，等.复合型生物衍生组织工程骨的制备及其理化特性［J］.云南医药，2004，25（6）：458460.
〔5〕 Mont MA,Jones LC,Einhom TA,et al.Osteonecrosis of the femoral head.Potential treatment with growth and differentiation factor［J］.Clin Orthop Relat Res,1998,（355 Snppl）:314335.
〔6〕 Zeng H,Du Jy,Zheng QX,et al.Effects of basic fibroblast growth factor on biological characteristics of osteoblasts［J］.Chin J Traumatol,2003,6（4）:229233.
作者单位：贵阳医学院附属医院急诊外科，贵州贵阳 550004；昆明医学院第一附属医院骨科，云南昆明 650032