骨髓间充质干细胞促进骨-肌腱结合部愈合的初步观察

【摘要】  观察骨髓间充质干细胞对骨-肌腱结合部愈合的影响。［方法］采用骨髓穿刺、全骨髓培养法获取兔骨髓间充质干细胞。36只18周龄新西兰大白兔随机分为2组，实验组将骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127载体材料结合后，植入兔髌骨部分切除模型，对照组只进行手术，不植入细胞。在术后6、12、18周进行X线片、大体和组织学观察评估。［结果］X线片显示术后6、12、18周实验组骨-肌腱结合部新生骨面积显著大于对照组(P<0.01)。大体观察可见实验组骨-腱结合部愈合较早。HE染色显示实验组术后6周有大量的纤维母细胞和类软骨细胞增生，并可见新骨形成；12周，髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成；18周，纤维软骨移行带排列更有序。Safranin 0染色显示实验组术后6周，基质染色较深，部分骨-腱结合处可见相对浓染区；12周，基质染色范围明显减少，沿类软骨细胞走行分布；18周，类软骨细胞集中的区域染色较12周有所减退。组织学检查显示实验组术后6、12、18周骨-腱结合部组织愈合明显，较对照组迅速。［结论］骨髓间充质干细胞可以促进骨-肌腱结合部细胞增生，促进其早期愈合。

【关键词】  骨髓间充质干细胞 骨-肌腱结合部 愈合

　　Primary observation on bone mesenchymal stem cells accelerating bonetendon junction healing∥DONG Fei,CHEN Honghui,YANG Xiaohong,et al.Guangzhou Research Institute of Traumatic Surgery, The 4th Affiliated Hospital, Jinan University,Guangzhou 510220,China

    Abstract：［Objective］To evaluate tho effects of Bone Mesenchymal Stem Cells(BMSCs) on healing of bonetendon junction in a patellar tendon complex.［Method］The BMSCs of rabbits were harvested by bone marrow aspiration. Adherent cells were selected as BMSCs after the whole marrow was cultured.Standard partial patellectomy was conducted in 36 18weekold rabbits divided into 2 groups. The experimental group was planted into by the composite of BMSCs and Pluronic F127 while the control group was only operated without BMSCs planting into.The patellarpatellar tendon complexes were harvested at weeks 6,12,18 postoperatively for radiographic, gross and histological evaluations.［Result］Radiographic measurements showed significantly more newly formed bone at the patellar tendonpatellar healing junction in the experimental group compared with that of the controls at weeks 6,12,18(P<0.01 ).The gross observations showed the tissue healing in the experimental group was quicker than that of the controls. Histologically, HEstained specimen showed in the experimental group considerable fibroblast and chondrocytelike cellular proliferation, new bones formed at week 6;chondroeytes transitional zone was formed at trabecular bonepatellar tendon junction at week 12; array of fibrocartilage transitional zone was ordered at week 18. Safranin Ostained specimen showed in the experimental group matrix was stained red at newly formed bone to patellar tendon junction,partially thick at week 6; matrix stains reduced and distributed along chondrocytelike cells at week 12,stains in the realm of chondrocytelike cells concentration was reduced than before at week 18. Histological observations showed more improved tissue integration in the experimental group at weeks 6,12,18.［Conclusion］BMSCs could accelerate early healing of bonetendon junction.

    Key words：bone mesenchymal stem cells;  bonetendon junction;  healing

    多种原因导致的肌腱止点的损伤，如肩袖损伤、网球肘、部分撕脱型跟腱断裂等发病率逐年增高。骨-肌腱结合部愈合过程比较复杂，该部位的特征性结构纤维软骨带的再生十分缓慢和困难［1］。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是多种间充质细胞的前体细胞，有多向分化潜能，传代繁殖能力强，生物相容性好等优点。本研究将骨髓间充质干细胞移植入兔髌骨部分切除模型中［2］，通过X线片、大体和组织学研究，观察其在骨-肌腱结合部修复中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  兔BMSCs体外分离，培养与扩增

    8周龄新西兰大白兔，无菌条件下抽取股骨干骺端骨髓3 ml，100目钢网过滤，1 200 r/min离心10 min，采用全骨髓培养法以（6～8）×104／cm2置于75 ml培养瓶培养，每瓶含10 ml培养液(含青、链霉素各100 U／ml，体积分数为20%胎牛血清，αMEM)，37℃、5%CO2孵箱中原代培养。4 d后半量换液，以后每48～72 h全量换液。当细胞融合达80％时，0.25％胰蛋白酶消化，以5×104／cm2接种到培养瓶传代，收集第3代细胞供移植用。

    1.2  BMSCs移植修复骨-肌腱结合部(bonetendon junction，BTJ)损伤

    1.2.1  实验动物及分组  36只18周龄新西兰大白兔，体重2.2～2.5 kg，随机分为实验组(BMSCs+载体Pluronic F-127)和对照组(只手术，不植入BMSCs和载体)，分6、12、18周3个时间点，每个时间点6只。

    1.2.2  兔髌骨部分切除手术［2］  麻醉下左下肢膝外侧入路，于髌骨远端1／3横行截骨，去除远端1／3髌骨，垂直近侧剩余髌骨钻2个0.8 mm的孔。髌韧带用不可吸收缝线缝合于近端髌骨上，实验组将BMSCs+载体复合物植入髌骨与髌腱之间，8字钢丝保护，膝关节石膏固定于屈膝90°位。6周后拆除石膏，笼内自由活动。在术后6、12、18周取材，分别作大体解剖检查，X线片分析及组织学观察。

    1.3  X线片观察

    在标本X线正位片中找出手术截骨线，观察从近端残余髌骨长出的新骨，由同一个检测者用Image J图像分析软件分析测量，得出新骨面积定量数值。

    1.4  资料的处理和分析方法

    X线片用SPSS11.5统计软件处理，双因素方差分析，对实验组、对照组的差异性进行统计学分析，P≤0.05(双尾)为差异具有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  BMSCs培养情况

    原代培养第6 d首次全量换液后，倒置显微镜下观察可见培养瓶中有许多增殖中的细胞克隆形成，克隆大小不一，最大可占据整个100倍视野，克隆中心向周围有放射状生长的贴壁细胞，形态多呈多角性、短梭形。随着换液，非贴壁细胞逐渐被弃掉。8～10 d后，各个集落之间基本融合达80％，予以传代，传代细胞呈长梭形，细胞生长密集时，其形态通常呈均匀一致的成纤维细胞样。

    2.2  X线片

    X线片经Image J软件处理，结果显示实验组6、12、18周的新生骨面积均明显增大(图1)，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，不同时间点各组内相比，差异也有统计学意义(表1)。表1  X线片髌骨新生骨面积

    2.3  大体观察

    实验组：术后6周，髌腱及髌骨背面见大量纤维组织增生，关节面光滑，截骨面可辨认，骨与腱接触面开始融合。12周，骨与腱部分区域已融合，截骨面不甚清晰。18周，骨与腱已融合，截骨面分辨不清。对照组：术后6周，髌腱及髌骨背面纤维组织增生明显，截骨面清晰。12周，截骨面清晰，骨与腱有融合趋势。18周，骨与腱大部分融合，截骨面隐约可见。

    2.4  组织学检查

    2.4.1  HE染色  实验组：6周，大量纤维母细胞和类软骨细胞增生，部分类软骨细胞排列成条带状，大部分细胞排列紊乱，可见新骨形成，并向髌腱内长入，隐约可见截骨界面(图2a)。12周，髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成，可见新生骨形成，截骨界面不明显，细胞排列较前有规律(图2b)。18周，截骨面已消失，可见大量活跃新生松质骨，软骨移行带排列更加有序，胶原纤维及细胞排列较前有规律(图2c)。

    对照组：6周，纤维母细胞增生，截骨面清晰，无新骨形成(图2d)。12周，仍有纤维母细胞增生，截骨界面模糊，可见多量类软骨细胞和新生松质骨增生，排列较有规律(图2e)。18周，可见软骨带和新生骨形成，类软骨细胞含量较多，胶原纤维排列较前有规律，截骨面不明显(图2f)。

    2.4.2  Safranin 0染色  实验组：6周，基质染色较深，新生骨与肌腱交界处的基质着红色，部分骨-腱结合处可见相对浓染区(图3a)。12周，基质染色范围明显减少，集中在部分骨-腱结合区的类软骨细胞聚集处，沿类软骨细胞走行分布，染色较浅。18周，骨-肌腱结合部类软骨细胞集中的区域被染成粉红色，较12周有所减退(图3b)。

    对照组：6周，基质染色较深，在骨-肌腱结合部有少量灶性分布染成红色的区域。12周，基质染色减少，可见骨-肌腱界面处有相对集中的基质红染区域，分布排列紊乱。18周，仍可见明显的基质红染，范围和程度有所增强(图3c)。图1  术后18周髌骨前后位X线片，显示术后骨-肌腱接点愈合界面新骨生成(箭头所指处为密度较低的新生骨，虚线为最初截骨处，右上角直线为标尺=7 mm)  1a.实验组  1b.对照组  图2  髌骨-髌腱复合体  HE染色100×  2a.实验组6周，大量的纤维母细胞和类软骨细胞增生(箭头所示)  2b.实验组12周，髌腱与松质骨接触面软骨细胞移行带形成(箭头所示)  2c.实验组18周，软骨移行带排列更加有序(箭头所示)  2d.对照组6周，截骨面清晰，无新骨形成(箭头所示)  2e.对照组12周，多量类软骨细胞和新生松质骨增生(箭头所示)  2f.对照组18周，软骨带和新生骨形成，类软骨细胞含量较多(箭头所示)  图3  髌骨-髌腱复合体Safranin 0染色(100×)  3a.实验组6周，基质染色较深，新生骨与肌腱交界处的基质着红色(箭头所示)  3b.实验组18周，基质染色较前减少(箭头所示)  3c.对照组18周，仍可见明显基质红染(箭头所示)。

　　3  讨  论

    骨-肌腱结合部是肌腱、韧带或关节囊与骨接触的部位。特征性结构是移行的纤维软骨带。典型的纤维软骨性骨-肌腱结合部有四层组织结构：纤维结缔组织、非钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨。该部位愈合过程比较复杂，手术技术、方式，局部的生物力学环境［3］，外固定时间等都对愈合和重塑产生重要影响。该部位的损伤，如跟腱或肩袖撕裂等愈合较慢。纤维软骨带的重建与修复对骨-腱结合部的愈合起到关键作用。

    近年学者对骨-肌腱结合部的愈合过程及如何促进其愈合进行了一些研究。Leung等［2］关于兔髌骨-髌腱复合体中骨-骨愈合和骨-肌腱愈合的比较研究显示骨-肌腱结合部在愈合界面之间及其周围区域形成大量瘢痕组织，瘢痕组织随愈合时间的推移逐渐重建。Wong等［4，5］发现软骨可能增强骨-肌腱结合部移行区的再生。徐钢、Lu等［6，7］发现低强度超声可以促进骨肌腱结合部的早期修复。陈鸿辉等［8］证实低强度超声和功能性电刺激可使骨、软骨等多种细胞增生，从而促进纤维软骨带重建和新骨形成。根据这项前期研究，作者想到BMSCs是多种间充质细胞的前体细胞，根据诱导环境的不同可分化为软骨、骨、肌腱等细胞，理论上可以促进骨—肌腱结合部多种细胞的增生，从而促进其愈合。近年Lim、Hong等［11，12］也发现BMSCs能促进骨隧道中骨-肌腱结合部的愈合。作者选用的细胞载体Pluronic F-127是由70％的聚氧化乙烯和30％的聚氧化丙烯构成的共聚物，能在不同温度下在固态和液态之间转化，平均降解时间为4～8周，对细胞增殖及活力无明显影响，无明显的免疫原性和抗原性［9，10］。

    本实验X线片结果说明，部分髌骨切除术后残余髌骨长出新骨。但大部分标本新生骨以松质骨为主，仍不够致密，残余髌骨和新生骨之间会成为比较薄弱的区域，正如Lu等［7］发现在髌骨髌腱复合体拉力实验中，被拉断的部位往往是截骨处，而不是新骨和髌腱界面。HE染色显示相同时间点比较，实验组的新生骨质量及软骨带成熟程度均优于对照组。这提示随着愈合时间的延长，在新骨和肌腱接点处重新生成了相对致密的过渡性纤维软骨带，新的骨-腱接点逐渐形成，BMSCs对骨-腱愈合有明显的促进作用。Safranin O染色显示6周实验组骨腱接点有较多糖氨多糖，证实有大量类软骨细胞形成；12周基质分泌糖氨多糖减少，类软骨细胞带开始向成熟软骨细胞移行带转化；18周类软骨细胞更多地转变为成熟软骨细胞，软骨带形成较对照组快。作者的研究结果表明BMSCs能够促进骨-肌腱结合部细胞增生，增加细胞基质合成，促进新生骨和纤维软骨移行带形成。

    综上所述，通过对兔部分髌骨切除模型的研究表明，骨—肌腱结合部随时间延长而逐渐恢复，骨髓间充质干细胞可以促进该部位早期愈合。

    致谢：本院放射科李国耀、陈松主管技师协助本研究的X光拍摄，特此致谢!

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作者单位：暨南大学医学院第四附属医院 广州市创伤外科研究所，广州 510220