骨髓间充质干细胞与成骨

【关键词】  细胞

    种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应该具有以下特点：结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖力强；自我更新，一定的条件下能向特定的方向分化；稳定表达成骨细胞表型；植入体内后能继续产生成骨活动；无致瘤性。目前，做为骨组织工程的种子细胞有4种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。比较而言，骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)是骨髓内存在的一类非造血干细胞，其在体内外具有支持和调控造血的作用，并且在体内可分布于多种组织和器官，并具有多向分化潜能，能够向成骨系细胞、成纤维系细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化，是目前应用较广泛的重要种子细胞之一〔1～3〕。

    1  BMSC的发现和命名

    早在1867年，德国的病理学家Cohnheim在研究伤口愈合的过程中，提出骨髓中存在有向非造血系统分化的干细胞，并提出了骨髓具有造血以外的功能。从那时起，科学家们对骨髓内这种可向多种组织分化的细胞的研究就没间断过。1869年，Goujon发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也说明了这一点〔4〕。但直到1968年Friendenstein等才首先通过体外培养发现从骨髓中能分离出具有向多种间质细胞分化的祖细胞，他们将骨髓标本放于塑料培养皿中，4 h后将非贴壁细胞倒掉，留下少量的贴壁细胞，其外观为纺锤形，这些细胞在早期处于休眠状态，随后迅速增殖，多次传代后仍保留原有的纺锤体形，当时他们称之为骨髓多能基质干细胞(marrow pluripotent stromal stem cells)。后来的学者相继称这类细胞为骨髓成纤维细胞(bone marrow fibroblasts)，骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells），骨骼干细胞(skeletal stem cells)，中胚层祖细胞(mesodermal progenitor cells)等等〔5〕。1985年，Owen认为骨髓基质细胞系统是伴随造血干细胞系统生长的，可以自我更新并分化为各种间充质组织的细胞群，由此提出骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells，MSC)的概念〔6〕。Pittenger等〔7〕利用梯度离心法，在骨髓中分离出成纤维样贴壁细胞，鉴于它们最终都可以分化为间充质系统细胞，所以定义为间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs）。有研究报道脂肪、肌肉、滑膜、松质骨等间充质组织中也分离出与骨髓来源MSC相似特性的细胞群，因此目前认为人体各种间充质组织中均潜藏MSC，它们在一定的信号机制调控下增殖、迁移、分化以修复机体老化和损伤的细胞或组织。故将骨髓来源的干细胞群命名为骨髓源性间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)，以便与其他来源的MSC相区别〔8〕。

    2  BMSC的分离培养

    BMSC在骨髓中的浓度不高，约占有核细胞的0.001％～0.01％，但组织工程对种子细胞的数量要求巨大，如此微量的BMSC难以满足需要，因此分离纯化和体外繁殖培养BMSC就显得尤其重要。

    目前用于分离纯化BMSC的方法主要有3种：(1)密度梯度离心与贴壁筛选法，骨髓经密度梯度离心，收集单个核细胞进行培养，同时根据各细胞贴壁能力及生长特性不同，控制一定的换液时间及胰蛋白酶消化时间，分离出MSCs;(2)流式细胞仪法(FACS)，根据细胞体积大小不同及其表达的标志物对细胞进行分选，得到高纯度细胞;(3)免疫磁珠法(MACS)，根据MSCs表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选，用抗体包被磁珠，获得相对纯化的MSCs。由于FACS和MACS对细胞活性的影响较大，甚至导致细胞失活，并且实验条件要求高，需要骨髓量大，而且目前尚未发现BMSC特异性很强的表面标志，因此很难用FACS和MACS对其进行准确的分选。密度梯度离心法和全骨髓贴壁法是常用于分离纯化BMSC的方法，用这种方法分离的BMSC中，虽然仍混杂着少量其他类型的细胞，如：脂肪细胞、成纤维细胞，但其数量已很少，而且随着传代增殖和诱导分化，细胞纯度进一步提高。最近研究发现，密度梯度离心法还能增加BMSC分化为成骨细胞的数量和提高碱性磷酸酶的表达。密度梯度离心，贴壁培养和消化控制相结合，具有操作简便、快速、实用等特点，是比较理想的分离纯化BMSC的方法〔9、10〕。

    3  BMSC的成骨诱导

    有资料〔11〕表明MSCs经过多个阶段才能分化成为骨细胞。根据不同时期用特异性的抗体标记成骨细胞的表面抗原，将演变过程进行了动态性的描述。其过程为：确定性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells，DOPC)-前成骨细胞(preosteoblasts)-过渡型成骨细胞(transited osteoblasts)-分泌型成骨细胞(secretive osteoblasts)-骨细胞性成骨细胞(osteocytic osteoblasts)-骨细胞(osteocytes)。目前，骨祖细胞尚无可识别的标记物。前成骨细胞和过渡型成骨细胞的碱性磷酸酶标记阳性，有高度的有丝分裂活性，但无分泌功能。分泌型成骨细胞的功能已成熟，有分泌基质的能力，却无有丝分裂的活性。新的被骨基质包围的成骨细胞转为骨细胞性成骨细胞，而此时的细胞是否具有分泌功能尚不确切，但最终将转为成熟的骨细胞。

    BMSC在无刺激培养液中呈纺锤状成纤维细胞，培养早期大部分由增殖快的小梭形细胞组成，随培养时间延长，逐渐被增殖慢、体积大的长方形、多角形成熟细胞替代，随培养时间延长，细胞形态逐渐趋于一致。由于BMSC具有分化多方向性的特点，而骨组织工程学要求其向单一方向分化，所以BMSC的定向诱导具有重要的作用。就其成骨方向来说，具有诱导作用的有：骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、地塞米松(dexamethasone，Dex)、维生素C、β-甘油磷酸钠，瘦素(Leptin)，骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)、雌激素(17beta-estradiol)、1，25(OH)2D、O3，甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)等等〔12〕。其中生长因子和地塞米松(dexamethasone，Dex)、维生素C、β-甘油磷酸钠研究较多。BMP是强有力的诱导因子之一，其至少有17种之多。诱导成骨最强的是BMP-2、4、7。BMP与Dex联合的骨诱导活性明显高于单独使用BMP。TGF-β是一种多肽，在调节骨代谢、骨改建过程中发挥重要作用。成骨细胞有高亲和力的TGF-β受体，受TGF-β的刺激后，可合成大量基质。TGF-β最初刺激成纤维细胞和成骨前细胞的有丝分裂，大量增殖分化为成骨细胞，增加骨钙含量。Dex诱导成骨分化的机理并不完全明了，有人认为在BMSC向成骨细胞分化早期，Dex以促进基质合成为主，后期则以促进钙化为主。BMSC经过Dex作用后，细胞的形态发生了改变，从长梭形变成了立方形，2～3 d内细胞内碱性磷酸酶的活性增加，7～14 d活性达到高峰。维生素C是体外培养细胞合成胶原的必备物质，并且能调节ATP酶的活性及蛋白的合成。β-甘油磷酸钠作为碱性磷酸酶的底物，可为成骨细胞提供磷离子，所以，可以和维生素C一起加速BMSC向成骨细胞分化促进钙化结节的形成〔13〕。

    4  BMSC成骨的应用研究

    4.1  复合支架研究

    支架材料及其与种子细胞的相互作用是骨组织工程需要解决的重要问题。骨基质明胶〔14〕、磷酸三钙、冻干骨等均可复合BMSC达到成骨的效果，但近年来研制力学性能和生物相容性均好的可降解多孔支架材料一直是研究的重点。吴巧凤等〔15〕将BMSC与不同比例的β-磷酸三钙(tricalcium phosphate，β-TCP)／聚乳酸(poly-lactic acid，PLLA)多孔支架材料复合后，通过荧光显微镜、扫描电镜以及MTT等方法初步比较了不同比例的材料对细胞生长状况的影响，结果显示不同比例的材料均具有一定的生物相容性，细胞生长良好。但以β-TCP/PLLA=2∶1的材料最好，对细胞的生长影响最小。汤亭亭等〔16〕研究结果显示人冻干骨(freeze-dried cancellous bone，FDB)与BMSC有良好的相容性。BMSC在冻干骨上孵育不同的时间(10 d内)，对其植入体内后的成骨能力没有明显影响。胡稷杰等〔17〕研究发现利用含BMP的聚乳乙醇酸(poly-D，L-lactide-co-glycolide，PLGA)支架与BMSC复合构建的新型组织工程骨具有良好的骨缺损修复能力。而孙伟等〔18〕采用纳米晶胶原基骨(nano-hydroxyapatite collagen，nHAC)和骨髓间充质干细胞复合材料修复兔股骨头坏死骨缺损的可行性，结果显示nHAC有较强的传导成骨作用，是修复兔股骨头骨缺损的良好移植材料，复合MSCs后能促进骨缺损的修复，对股骨头坏死的治疗有较大价值。但也有研究〔19〕提示骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石(coralline hydroxyapatine，CHA)可促进形成组织工程化骨，但在无应力刺激情况下，随时间延长，局部成骨活动减弱。

    4.2  基因研究

    代飞等〔20〕利用人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-免疫球蛋白融合蛋白(hCTLA4-Ig)基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为种子细胞异种移植到F344大鼠体内可以成骨，从而获得骨组织工程异基因种子细胞的一种方法。还有一些研究对体外扩增的BMSC进行基因转染增加其骨形成能力。如Riew等〔21〕报道体外转染BMP-2的BMSC可以促进猪的椎体间融合，而转染空白基因的对照组则无此作用。李建军等〔22〕利用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因修饰的组织工程骨诱导生成软骨组织并向编织骨转化，12周骨缺损修复，髓腔再通，新骨强度明显优于其他各组。Chamberlain等〔23〕报道利用基因修饰BMSC治疗成骨不全的研究，这也为自体BMSC治疗各种先天性、遗传性骨病提供了新思路。

    5  前景与展望

    作为骨组织工程的种子细胞，BMSC来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养，体外增殖能力强，大量传代培养后仍具有成骨能力。因此BMSC在骨组织工程和细胞治疗中具有广阔的应用前景，也为骨科疑难问题提供了新的解决途径。Kon等〔24〕报道，自体移植经体外扩增的骨髓间充质细胞，在短期看来是安全有效的。然而，移植的骨髓间充质细胞是否对患者有利，至今无法肯定。Kang等〔25〕报告，骨髓基质细胞移植后短期内将会出现骨矿物质的代谢紊乱，从而导致骨形成障碍和骨吸收增加。

    目前对BMSC及其成骨方面的研究虽已取得了很大的进展〔26〕，但该领域的研究尚处于探索阶段，以下问题有待解决：(1)实验证明体外的BMSC均为各种细胞的混杂。如何才能有效地获得纯的BMSC，有待于对BMSC的细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的研究。(2)BMSC的增殖、分化的控制需要合适的条件。如何使既控制增殖，避免成肿瘤，又能在适当的时候启动沿所需路径的分化?需今后进一步研究。(3)对BMSC在各种力学条件下的改变还知之甚少，而BMSC在骨髓中及用于骨组织工程显然要受到周围环境的力的作用。对这方面的研究将促进对BMSC全面了解和有效利用。(4)目前的骨组织工程研究中，已证实BMSC能与多种材料相容生长并在体内成骨，但这些材料自身的缺陷使得人们不断尝试使用新的载体材料，如何促进BMSC与理想材料相容生长并成骨将是今后骨组织工程研究的重要方面。

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作者单位：山东省东营市利津县第二人民医院外二科，257447