愈合期与正常内侧副韧带细胞生物学特性差别比较的实验研究

【摘要】  ［目的］探讨愈合期膝内侧副韧带与正常内侧副韧带成纤维细胞增殖及α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，αSMA)合成能力的差别。［方法］选取成年雄性SD大鼠12只，体重350～375 g，无菌切取正常内侧副韧带与愈合期韧带，以眼科剪剪成1 mm×1 mm×l mm大小，并将其置于培养瓶中，0.25％胰蛋白酶消化传代制备成纤维细胞。取第3代MCL细胞，培养24、48 h后，采用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖。另外，通过WesternBlot法测定各组细胞αSMA的表达。［结果］培养24、48 h后，MTT法测得愈合期韧带细胞增殖的吸光度值分别为0.49±0.08和0.53±0.07，与正常韧带细胞比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示，愈合期韧带细胞αSMA表达量明显高于正常韧带细胞，是正常韧带细胞的1.7倍，差异有统计学意义(P<0.05)。［结论］愈合期韧带细胞增殖及αSMA表达能力均明显较正常韧带细胞强，这为了解韧带愈合过程以及如何能提高韧带愈合质量在细胞及分子水平提供了充分的理论基础。

【关键词】  膝内侧副韧带； 成纤维细胞； α平滑肌肌动蛋白； 细胞增殖

    Biological differences between healing and normal medial collateral ligament fibroblasts∥JIANG Dapeng,LI Zhaozhu,ZHANG Yubo,et al.Department of Pediatric Surgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China

    Abstract：［Objective］To examine the difference of proliferation and αsmooth muscle actin(αSMA) expression between healing and normal medial collateral ligament (MCL) fibroblasts.［Method］Ten adult,male,SpragueDawley rats weighing between 350 and 375 g were used in this study.Normal and healing MCL were cut into small pieces in aseptic conditions,and then placed and cultured in culture chamber.Fibroblasts were passaged with 0.25% trypsin.After 24 and 48 hours incubation,MTT was used to measure the cell proliferation.The production  of αSMA was measured by Western Blot.［Result］After 24 and 48 hours incubation,healing fib roblasts showed absorbency values of 0.49±0.080 and 0.53±0.07 respectively.II was found that healing fibroblasts proliferated faster than normal fibroblasts (P<0.05).Healing fibroblasts had 1.7 fold greater protein expression of aSMA than normal fibroblasts (P<0.05).［Conclusion］Healing fibroblasts possess a faster proliferation and higher aSMA protein expression than normal fibroblasts.The findings provide a cellular and molecular basis for realizing the mechanism and improving the quality of healing process.

    Key words：knee medial collateral ligament;  fibroblast;  αsmooth muscle actin;  cell proliferation

    随着人们参加体育运动的增加，内侧副韧带(medial collateral ligament，MCL)损伤的发生率逐年增加。MCL愈合后组织学、生物化学及生物力学特性均有所改变，愈合后不能恢复正常韧带的强度和弹性，受牵拉后容易再次断裂［1，2］。成纤维细胞在损伤韧带修复重建过程中发挥着重要的作用。正常韧带与愈合期韧带成纤维细胞的生物学特性可能存在着差别［3］。深入探讨这种差别可以为认识韧带损伤愈合的细胞及分子机制提供理论依据，并可以为提高韧带愈合质量提供新的治疗策略。本实验对愈合期MCL成纤维细胞增殖及α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，αSMA)表达能力与正常韧带成纤维细胞作了系统的比较。

    1  材料和方法

    1.1  试剂

    DMEM(美国GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT、DMSO(美国Sigma公司)，小鼠抗αSMA单克隆抗体、碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗βactin单克隆抗体(美国Santa Cruz)，RIPA蛋白裂解液、BCIP／NBT底物显色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)，GIS数码凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司)，酶标仪(Reader，日本)。其余有关分子生物学试剂由哈尔滨医科大学附属第二医院中心实验室提供。

    1.2  MCL细胞培养

    参照Agarwai［4］的方法，选取成年雄性SD大鼠12只(体重350～375 g)，用1％戊巴比妥钠(40 mg／kg)腹腔内注射麻醉，双膝部剃毛、消毒，于膝关节内侧作1 cm长的纵切口，将MCL暴露，实验组用手术刀片将左侧MCL在胫骨结节水平横断，横断处形成一约2 mm宽的缝隙，断端处以黑色丝线打结作为标记，然后以5-0可吸收线缝合皮肤。对照组暴露右侧MCL后即缝合皮肤。手术后将大鼠重新投入各自笼中饲养。至术后第10 d，将膝关节处正常韧带与愈合韧带取下，根据手术时黑色丝线结节标记及愈合处韧带局部增粗来判断韧带愈合处肉芽组织，将该愈合部位韧带剪下作细胞培养。对照组(假手术组)则在相当于实验组取材部位剪下约2 mm的一段作细胞培养。无菌切取的MCL放入含100 u／ml PG和100 μg／ml SM双抗Hank's液中，反复冲洗并用解剖刀去除韧带外周组织，以眼科剪剪成1 mm3大小，并将其置于培养瓶中，将组织小块摆布在培养瓶底上，轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，置于37℃含5％CO2、95％空气的二氧化碳培养箱内4 h，然后取出培养瓶，加含15％胎牛血清的DMEM培养液后再缓慢翻转培养瓶，置培养箱内静止培养，待细胞从组织块爬出，再补加DMEM培养液。待细胞生长成单层后，以胰蛋白酶消化传代。

    1.3  MTT法测定韧带细胞增殖

    收获第3代的MCL细胞，以2.5×104细胞／孔的浓度，接种于96孔培养板上，每组4个复孔。CO2培养箱内培养。培养24、48 h后，每孔入MTT溶液(5 mg／ml)20 μl，在37℃、5％CO2培养箱内继续孵育4 h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。然后每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上测定各孔光吸收值(波长490 nm)。

    1.4  WesternBlot检测αSMA表达

    收集两组细胞，加入RIPA细胞裂解缓冲液裂解细胞，冰浴20 min，4℃ 3 000 r/min离心15 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度。取等量的(5 μg)细胞总蛋白按常规方法进行12％聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)变性电泳，继之20 mA恒流半干式电转移法将蛋白印迹转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉于4℃封闭过夜，TBST洗涤液洗膜4次，每次5 min。加入小鼠抗αSMA单克隆抗体(1∶250)，37℃孵育1 h，洗膜。加入碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG(1∶750)，洗膜后以BCIP／NBT底物显色试剂盒显色，天能凝胶成象分析系统扫描条带并分析。以βactin作为内参，计算相对值。实验重复3次。

    1.5  统计方法

    采用SPSS 10.0统计软件包进行统计学处理，实验数据以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用配对t检验。P<0.05为具有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  愈合期韧带与正常韧带成纤维细胞增殖差别

    如表1所示，愈合期韧带与正常韧带细胞增殖存在明显的差别。经过24、48 h的培养，愈合期韧带细胞增殖的速率均明显高于正常韧带细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。表1  愈合期韧带与正常韧带成纤维细胞的增殖说明：24、48 h时愈合期韧带与正常韧带成纤维细胞的增殖均具有显著性差异(P<0.05)。

    2.2  愈合期韧带与正常韧带成纤维细胞αSMA表达的差别

    Western Blot结果显示，愈合期韧带细胞αSMA表达量明显高于正常韧带细胞。半定量分析提示，愈合期韧带细胞αSMA表达量是正常韧带细胞的1.7倍(图1)，差别有统计学意义(P<0.05)。

    图1  愈合期韧带与正常韧带成纤维细胞αSMA的表达  *P<0.05，与正常组比较差异有统计学意义

    3  讨  论

    随着人们体育运动的增加，MCL损伤在肌肉骨骼系统病变中所占的比例亦逐年增高。轻度的MCL损伤可以自愈，不需要外科处置，但自愈后的MCL在组织学、生物化学、生物力学特性等方面均有所改变，表现为：胶原排列紊乱、胶原交叉结合减少、胶原纤维变细及减少、胶原成分改变，愈合后韧带的抗拉力减低［2，5］。由于正常韧带细胞与愈合期韧带细胞存在于不同的内环境，正常韧带细胞仅维持韧带基质成分的稳定，而愈合期韧带细胞在损伤后修复重建过程中发挥着重要的作用［4］，其生物学特性必然存在着差异。

    组织损伤后，局部细胞增殖移行能力增强，以此来达到组织修复的目的，韧带愈合过程亦是如此。本实验结果显示，经过48 h的培养，愈合期韧带细胞较正常韧带细胞增殖速率快。细胞增殖能力的增强有利于韧带的修复，但增殖细胞的生物学特性对愈合后韧带的结构及生物力学特性有着密切的关系。通常，损伤后组织愈合时多表现为过度收缩，而这种过度收缩是由损伤部位大量表达αSMA的肌成纤维细胞导致，最终诱发瘢痕的形成，这对愈合后韧带的结构及生物力学特性必将产生严重的影响。肌成纤维细胞由愈合过程中成纤维细胞转分化而来，其一定程度的收缩对于伤口的闭合是必需的，但过度收缩则可导致愈合组织瘢痕的形成［6］。本实验发现，愈合韧带成纤维细胞αSMA表达明显高于正常韧带细胞，αSMA是肌成纤维细胞的标志物［7］。由于本实验中每孔的蛋白上样量均一致，所以两组间细胞数的差别不影响蛋白印迹的结果。肌成纤维细胞多出现在组织损伤后4～6 d，它的活性可保持到损伤后2～3周。Agarwal［4］等曾提出利用RNA干扰技术下周愈合期韧带细胞αSMA的表达可能是减弱成纤维细胞过度收缩的有效方法，从而可以减轻韧带愈合后瘢痕产生并改善愈合后的生物学功能。

    本实验发现，即使细胞被传代至第3代，两组间差别依然显著，这种差别在体内可能维持更长的时间。因此，应采取必要的措施对愈合期韧带细胞的生物学行为进行调控。实验中考虑到手术操作时皮肤切开等可能会影响MCL成纤维细胞，本实验利用假手术组作为对照，这样可以将韧带横断以外的手术操作影响因素排除。另外，取愈合10 d的韧带组织是由于此时韧带成纤维细胞正处于增殖活跃的阶段［3］。实验中仅观察了部分时间点的差别，将来的实验应对愈合韧带与正常韧带细胞的差别作动态观察。

    总之，本实验发现愈合韧带细胞增殖及αSMA表达能力明显较正常韧带细胞强，这为了解韧带愈合过程以及如何能提高韧带愈合质量在细胞及分子水平提供了充分的理论基础。

【参考文献】
  ［1］ 姜大朋，李昭铸.膝部韧带损伤愈合机制及其组织工程学治疗进展［J］.中国康复医学杂志，2006,10: 941-943.

［2］ Liang R,Woo SL,Takakura Y, et al． Longterm effects of porcine small intestine submucosa on the healing of medial collateral ligament: a functional tissue engineering study［J］.J Orthop Res,2006,4:811-819.

［3］ Kydd AS,Achari Y,Lu T, et al． The healing rabbit medial collateral ligament of the knee responds to systemically administered glucocorticoids differently than the uninjured tissues of the same joint or the uninjured MCL: a paradoxical shift in impact on specific mRNA levels and MMP13 protein expression in injured tissues［J］.Biochim Biophys Acta,2005,3:289-299.

［4］ Agarwal C,Britton ZT, Alaseirlis DA,et al． Healing and normal fibroblasts exhibit differential proliferation,collagen production,alphaSMA expression,and contraction［J］.Ann Biomed Eng,2006,4:653-659.

［5］ 李贤让，陈鸿辉，沈 雁，等.酸性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子对兔韧带细胞增殖的影响［J］.中国矫形外科杂志，2003,10:689-691.

［6］ Nedelec B,Ghahary A, Scott PG,et al． Control of wound contraction.Basic and clinical features［J］.Hand Clin,2000,2:289-302.

［7］ Gabbiani G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases［J］.J Pathol,2003,4:500-503.

作者单位：(哈尔滨医科大学附属第二医院小儿外科，哈尔滨 150086)