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【摘要】 采用体外检测与体内植入两种方法，分别检验镁合金的生物安全性。以此初步探讨镁合金作为一种新型的骨科内置物材料的可行性。［方法］ 取国际通用标准的L929小鼠成纤维细胞作为检验细胞。在体外培养扩增至5代后，应用镁合金浸提液作为培养液，行体外培养扩增，在光学倒置显微镜下观察细胞的形态和增殖情况。另外，应用MTT法检测细胞毒性。实验分为3组，即镁合金浸提液实验组和阳性阴性对照组，在培养1、3、5、7 d后分别测量吸光度值，SPSS软件分析各组间吸光度值差异，间接判断细胞增殖情况。并计算细胞相对增殖率(RGR)，评定各组毒性级别。体内植入实验则将镁合金棒横向植入大鼠左股骨干内，分别在术后5、9、18周时进行血生化指标检测，并于18周时处死大鼠，取肝、肾行病理分析，观察肝、肾病理形态改变。［结果］L929小鼠成纤维细胞正常，增殖活跃。MTT法经分析比较，实验组与阴性对照组的吸光度值无明显差异(P>0.05)，而与阳性对照组有显著差异(P<0.05)。这说明镁合金浸提液对细胞生长无不良影响，同时RGR结果显示镁合金细胞毒性评级为0级，无细胞毒性作用。动物体内实验显示，大鼠植入镁合金后各时间段的生化指标未见明显波动，肝、肾病理分析未见明显异常。［结论］镁合金对L929小鼠成纤维细胞有良好的生物相容性，对植入的动物也未见不良的影响，具有良好的生物安全性。因此可以初步认为镁合金作为一种新型的，有潜力的骨科内置物材料是可行的。
【关键词】 镁合金 体外检测 体内植入 生物安全性
Biological safety study of magnesium alloy used in body∥YU Guo-ning, PAN Feng,WEN Jiu-quan, et al. Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001，China
Abstract ［Objective］To check the biological safety of magnesium alloys by two means of detection in vitro and implant in vivo, and from that try to find out the possibility of magnesium alloys to be a new type of bone surgery implant materials.［Method］ L929 mouse fibroblasts were used to be test cells, cultured and subcultured in vitro. At 5th generation , the cells were cultured and developed by leaching liquor of magnesium alloys, and then observed by optics inverted microscope.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) was used to check cytotoxicity. There were 3 groups of experiments: leaching liquor group, masculine group and negative control group.After 1, 3, 5, 7 days, absorbance(Abs) value were measured, the difference between groups was measured by SPSS software to judge the change of cells indirectly. Relative growth rate(RGR) of cells were calculated to evaluate the toxicity level of groups. SD rats left femur were filled with magnesium alloy stick transversally, then the biochemical indicators were checked after 5,9, 18 weeks, and the pathological change of liver and kidney were observed after 18 weeks.［Result］ After culture in leaching liquor, the fibroblasts well developed. There was no difference between leaching liquor group and negative control group(P>0.05), while there was significant difference between leaching liquor group and masculine group(P>0.05). RGR showed that the toxicity level of magnesium alloys was 0. And there was no significant abnormality found in biochemical indicators and pathological analysis after inplant in vivo.［Conclusion］Magnesium alloys showed good biocompatibility to L929 mouse fibroblasts, and had no cacoethic effect to test animals, so the magnesium alloys is possible to be a new type and potential of bone surgery implant materials.
Key words：magnesium alloys; detection in vitro； implant; biological safety
1 引言
由于各种医用装置材料植入体内后都将与组织和细胞直接接触，因此，作为用于体内的生物金属材料必须具备良好的力学性能和生物安全性能［1］。本课题组研制了硬度、弹性模量更接近骨质，且压缩性能明显优于其他医用金属材料，在生物体内可降解的新型镁合金，根据国内外评价医用生物材料及装置的标准，本实验拟从体内体外两个方面初步研究镁合金的生物安全性能。
2 材料与方法
2.1 材料准备
2.1.1 金属片制备
镁合金由镁(98wt%)、锰(1wt%)、锌(1wt%)组成，制成直径8 mm，厚度1 mm的圆形薄片，以及相同尺寸大小的纯铅金属片，由中国科学院金属研究所提供。高温高压消毒后备用。
2.1.2 成纤维细胞培养及营养液制备
小鼠成骨细胞购自南京凯基生物科技有限公司的L929小鼠成纤维细胞。培养液使用DMEM低糖培养基(Gibco)加入20%灭活胎牛血清(杭州四季青)，青霉素100 u／ml，链霉素100 u／ml；细胞消化液用胰蛋白酶(1∶250，Sigma)溶解于d-hank’s液，过滤灭菌。
2.1.3 试样浸提液制备
将试样材料在超净台中置于无菌瓶中，按材料面积与浸提液为3 cm2／ml的比例加入无菌DMEM培养液，于37℃下，在细胞培养箱中浸泡24 h。
2.2 实验方法：
2.2.1 MTT细胞毒性试验
将扩增传代至第五代的小鼠L929成纤维细胞株用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞数制成1×104个／ml的细胞悬液。取96孔培养板4块，每孔加入细胞培养液100 μl，放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养24 h，使细胞贴壁，每块培养板加浸提液100 μl，使孔内最终浓度为50%。阳性对照组加纯铅浸提液，阴性对照组加DMEM培养液。每组8个孔，放入37℃，含5%CO2的培养箱中继续培养。在第1、3、4、7 d各取一培养板在倒置显微镜下观察活细胞形态并照相。加入1 mg／mlMTT，每孔50 μl，细胞培养箱中培养3 h后取出，吸出孔内液体，加DMSO 150 μ1，微震荡10～15 min，用酶标仪(wellscan MK3酶标仪，Labsystems中国集团制造)测量吸光度值，试验波长为490 nm。
2.2.2 数据计算
采用SPSS分析软件整理数据，将同一时间的MTT法吸光度值作方差分析和均数间两两比较。计算细胞相对增殖率RGR。公式为RGR=实验组吸光度均值／阴性对照组吸光度均值×100%。根据6级毒性评分标准转换成毒性级。
2.2.3 体内植入实验
SD大鼠5只，雌雄不限，体重300～350 g；镁合金棒(中科院金属研究所)，长3 mm，直径1.5 mm；将大鼠用1%戊巴比妥(40～50 mg／kg)腹腔注射麻醉，侧卧位，在左股骨干上1／3外侧，用电钻垂直于骨干方向钻孔，对穿，将镁棒植入，冲洗清洁伤口，缝合。
2.2.4 生化指标检测及病理分析
每只大鼠均在术前、术后5周、9周、18周取血做生化检测(全自动血液生化分析仪，日本日立7020)，于术后18周处死行肝、肾病理切片分析。
3 结果
3.1 细胞形态学观察
第1 d，细胞部分贴壁，呈梭形或多角形(图1a)；第3 d，细胞形态正常，数量有所增加(图1b)；第5 d，细胞聚集生长，密度更大(图1c)；第7 d时，细胞增殖明显，排列密集规则，达到传代水平(图1d)。
3.2 MTT法检验
MTT法检测结果见表1，RGR及毒性级别如表2所示。除培养1 d组外，其余时间组内阳性对照组的吸光度值明显低于其它组，均有明显差异(P<0.05)。阴性对照组和镁合金组间无明显差异(P>0.05)。按IS 0.7405文件规定细胞毒性0～1级为合格，所以此镁合金无细胞毒性。表1 实验中材料吸光度值(x-±s)试样第1 d第3 d第5 d第7 d镁合金0.2235±0.09810.3183±0.08680.5464±0.08420.5876±0.0735阳性对照0.1984±0.12350.2426±0.14520.3745±0.10350.3923±0.1537阴性对照0.2154±0.15110.3466±0.10790.5676±0.07720.6538±0.0672表2 实验中各材料RGR及材料毒性级别试样生化检测指标如表3所示，术后ALT、GLO随时间延长略有升高，各个时间段大鼠的其余生化指标未见异常，尤其是镁离子含量，并没有因为植入镁合金而升高，显示肝肾功能状态良好。表3 术后各时间段血生化检测序号项目中文名称单位范围［1］空白
3.4 肝肾病理分析
术后18周处死大鼠行肝脏病理分析(图2)和肾脏病理分析(图3)，肝细胞可见轻度颗粒样变性，肝汇管区少量浆细胞和淋巴细胞浸润；肾组织病理未见异常改变，肾小管上皮，细胞结构清晰，无变性或充血，未见炎性细胞浸润。这说明肝、肾组织结构未受明显影响。 图1镁合金浸提液培养1 d后，细胞贴壁呈梭形，细胞数量较少；3 d后，细胞数量略有增加，细胞形态无明显变化；5 d后细胞数量明显增加，聚集生长；7 d后，细胞密度更大，排列规则紧密，达到传代水平。1a1b1c1d3d5d7d (×200) 图2植入镁合金术后18周，肝汇管区少量淋巴细胞、浆细胞浸润。部分肝细胞轻度颗粒样变性HE染色×200 图3植入镁合金术后18周，肾小管上皮细胞结构清晰，无变性或充血，未见炎性细胞浸润，肾组织未见异常改变。HE染色×2004 讨论
镁合金作为一种可降解的金属材料，必然会在降解过程中释放出金属颗粒及离子。体外应用浸提液试验的原理，就是利用医用装置及金属材料可以释放出一些物质，这些物质一般是原料单体、低分子聚合物、金属颗粒或离子等，可以对细胞的生长增值产生影响，通过MTT法及直观观察细胞的生长状况，间接地判断医用材料的组织相容性［2］。
从图1和图2可以看到，小鼠成纤维细胞在镁合金浸提液的培养下生长良好。表1和表2显示镁合金的细胞毒性为0级，无细胞毒性。从图3可以看到，肝汇管区有少量淋巴细胞和浆细胞浸润，部分肝细胞轻度颗粒样变性，这是机体对异物发生排斥反应的一种表现。从图4看到，肾脏组织几乎未见异常，这也可以解释了表3中肝功各项在术后5周时明显升高，而在术后9周和18周时又趋于正常；肾功生化指标未见明显异常的原因。而镁、钙、钾等离子主要通过小肠吸收和肾脏代谢，只要肾功能正常，则多余的镁离子会通过肾脏排出体外，不会对机体造成明显影响。
最终检测结果证明，镁合金具有良好的组织相容性。这可以从以下几个方面分析：
首先，镁合金中的镁、锰、锌元素都是正常体内所必需的元素。镁是体内第4大阳离子，其中有一半储存在骨组织中，而且镁是骨组织代谢的重要元素之一［3］。很多实验已经证明镁合金具有良好的骨诱导作用，其中镁离子在成骨过程中发挥了巨大的作用［4］。
其次，镁合金在降解过程中，在金属表面形成一层钙磷复合层组织，这层组织既有利于新生骨组织的形成，又减缓了镁合金的降解速度，阻止金属离子的快速析出，避免了局部形成高浓度的离子聚集而对机体造成损害［5］。现在，许多人意识到很多材料的成骨诱导性依赖于生理环境中羟基磷灰石的沉积，所以出现了一种生物涂层的拟生态方法。无定形的磷酸钙或镁钙磷酸盐分别在镁合金表面涂层，发现其降解层内的变化相似，均在增强细胞粘附性的同时延缓了镁合金的降解过程［6］。因此，在镁合金表面进行修饰是一个很好的研究方向。
5 结论
任何一种金属材料应用于临床最基本的前提条件，应是对机体无害，生物安全性好。本实验从体内和体外两个方面进行研究，更具有全面性。通过对各项结果的综合分析，可以初步认为镁合金具有良好的组织相容性，即良好的生物安全性。当然，对于镁合金在体内降解影响因素和机体的反应机制，以及镁合金的远期植入效果及表面理化性质的修饰还需要做进一步的研究。
【参考文献】
［1］ Niinomi M. Recent metallic materials for biomedical applications［J］. Met Mater Trans A，2002，33:477-486.
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［6］ Kuwahara H, Al-Abdullat Y, Mazaki N, et al. Precipitation of magnesium apatite on pure magnesium surface during immersing in Hank’s solution［J］. Mater Trans，2001，42:1317-1321.
作者单位：中国医科大学附属一院骨科，沈阳 110001