骨髓间充质干细胞修复假体周围骨缺损及对假体界面骨整合的影响

【摘要】  观察骨髓间充质干细胞修复假体周围骨缺损及对假体界面骨整合的影响。［方法］取新西兰大白兔15只。将骨髓间充质干细胞分离、扩增、骨向诱导，体外与珊瑚羟基磷灰石复合构建组织工程骨。将动物双侧股骨髁制作0.6 cm×1.2 cm的骨缺损，分别植入钛合金植入体，左侧植入体周围骨缺损充填组织工程骨，右侧植入体周围仅充填珊瑚羟基磷灰石为对照组。于术后4周、8周和12周分别行X线检查、扫描电镜、能谱分析及脱钙骨组织学观察。［结果］X线检查示，实验组术后4周缺损区内可见部分骨痂形成，与周围骨质分界清晰；8周可见大量模糊高密度骨痂影；12周缺损区已基本被高密度骨痂所填满，与周围骨质间分界变模糊。对照组4周、8周无明显改变，12周仅边缘有少量的骨痂形成；X射线能谱分析示，不同时间点实验组较对照组内Ca、P的百分含量增高（P＜0.05），随着时间的变化两组Ca、P百分含量都呈增高的趋势。实验组钙/磷比值随时间变化有逐渐升高的趋势，8周时达高峰，随后又降低。组织学结果示实验组术后12周可见明显的新骨形成，但仍可见到未吸收的羟基磷灰石颗粒。对照组各时间点均未见骨长入。［结论］骨髓间充质干细胞骨性诱导后复合珊瑚羟基磷灰石构建组织工程骨可修复假体周围骨缺损，促进假体骨界面骨整合。

【关键词】  骨整合 组织工程 骨髓间充质干细胞 珊瑚羟基磷灰石 人工关节

    Effects of bone marrow stromal stem cells on bone defect around the implant and osteointegration of implant-bone interface∥FU Zhi-hou, WANG Ai-min. Department of Orthopaedics, Daping Affiliated Hospital of the Third Millitary University of PLA, Chongqing 400042, China

    Abstract ［Objective］To investigate the effects of bone marrow stromal stem cells(MSCs) on the bone defect around the implant and the osteointegration of implant-bone interface.［Method］Fifteen healthy clean New Zealand rabbits were studied. MSCs were separated, cultured and induced to osteoblasts. Cancellous bone defects（0.6×1.2 cm）were created in bilateral femur condyle in rabbits. Titanium alloy columns (0.3×1.0 cm)were implanted into both defects.Tissue engineering bone was implanted around the left titanium alloy implant，but only hydroxyapatite ceramic in the right.The  biological characteristics were evaluated by X-ray examination, SEM , energy dispersive X-ray analysis and histologic studies at 4, 8, and 12 weeks postoperatively.［Result］ X-ray examination showed the density of bone tissue around the implant was aequalis. The interspace between implant and bone was filled with lots of bone trabeculae in the experimental group at 12 weeks postoperatively. The density of bone tissue was inhomogeneous, and low-density umbra existed in the interspace in the control group. Energy dispersive X-ray analysis showed the content of the Ca and P in the experimental group was statistically higher than that in the control group at different time points（P＜0.05） With the time going by, the content of the Ca and P in both groups had a tendency to increase gradually. They showed no statistical significance between 12 and 8 weeks postoperatively（P＞0.05. The ratio of Ca to P became higher and reaching the peak level at 8 week. Histological study showed the bone defects around the implant were repaired by new mature bone in the left at 12 weeks postoperatively, while in the right no new bone was found at any time point.［Conclusion］The compounds of hydroxyapatite ceramic and osteoblasts induced by MSCs can repair the bone defect around the implant and improve the osteointegration of implant-bone interface.

    Key words：osteointegration;  tissue engineering;  bone marrow stromal stem cell;  coral hydroxyapatite ceramic;  arthroplasty

    人工关节置换技术被认为是20世纪骨科最成功的治疗方法之一。人工假体的出现解决了许多从前不能实现的难题，但其也不是毫无瑕疵的，如感染、松动等，其中假体无菌性松动是导致人工关节置换术后中远期失败的主要原因。大量的分析研究表明假体-骨组织界面微动磨损是导致人工关节松动的一个主要因素。文献报告假体材料、表面特性及周围微环境等均可影响生物性假体周围骨长入。本文应用骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cell，MSCs)骨向诱导后复合珊瑚羟基磷灰石构建组织工程骨修复假体周围骨缺损，观察骨髓间充质干细胞对假体骨界面骨整合的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物

    5～7月龄健康清洁级新西兰大白兔(济南军区总医院动物中心，编号：SCKX 204057)15只，5个月月龄，体重2.5～2.9 kg，雌雄不限，分笼、颗粒干饲料喂养。饮用自来水。

    1.2  材料

    珊瑚羟基磷灰石为颗粒状5P10R（直径1～4 mm），孔径大小400～500 μm，空隙率30%～70%，由北京意华健科贸有限公司提供。钛合金植入体为Ti-6Al-4V，直径3 mm,由北京百慕高科股份有限公司提供。

    1.3  方法

    1.3.1  骨髓MSCs的分离、培养与骨向诱导

    无菌条件下于兔股骨大转子下穿刺，抽取骨髓约5 ml后缓慢注入含10 ml淋巴细胞分离液的离心管中；2 500 r/min离心15 min,吸取界面层细胞,用D-Hanks平衡盐溶液洗2次,2 500 r/min离心10 min；将细胞悬液按4×105/mL接种于75 ml培养瓶内,按贴壁筛选法分离骨髓MSCs。7 d后细胞生长状态良好，已铺满瓶底的50%后按1∶3比例传代。取第4代骨髓MSCs将基础培养液更换为成骨诱导培养液（10-8mol/L地塞米松+10 mmol/L甘油磷酸钠+ 50 mg/L维生素C， pH7.3 0）。置37℃、 5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。每3 d换1次液。第12 d行ALP染色、茜素红染色及I型胶原免疫组化染色，鉴定成骨细胞。

    1.3.2  体外组织工程骨的构建

    将骨髓MSCs密度调整到106/ml，先加100 μl成骨诱导培养液于24孔培养板底，放入珊瑚羟基磷灰石颗粒，向材料表面加100 μl成骨细胞悬液，放置37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养2 h，翻转后另一面再加100 μl成骨细胞悬液，培养2 h，加入成骨诱导培养液盖过材料，放置37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中孵育，次日改换成骨诱导培养液，孵育1周。

    1.3.3  动物模型的建立

    速眠宁耳静脉麻醉后，无菌条件下取兔左侧膝关节外侧切口，显露股骨外髁，切去骨膜。用直径0.6 cm环锯由外髁向内髁方向制作一0.6 cm×1.2 cm的松质骨穿通性骨缺损，植入钛合金植入体0.3 cm×1.0 cm，周围用组织工程骨填塞、压实，关闭切口。同法制作右侧股骨髁骨缺损，钛合金植入体周围仅植入珊瑚羟基磷灰石作为对照。

    1.4  观察指标

    1.4.1  一般情况：包括观察动物进食、切口愈合情况。

    1.4.2  放射学观察：于术后4、8、12周拍摄双膝关节正侧位X线片，了解骨缺损修复、骨小梁形成情况。

    1.4.3  扫描电镜及能谱分析：术后4、8、12周分别处死5只动物，取植入体及周围骨组织，喷镀后制成扫描电镜标本，采用JSM-5800LV型扫描电镜，行扫描电镜观察及能谱分析。

    1.4.4  组织学观察：切取股骨髁骨标本，用10%中性福尔马林固定，脱钙，树脂包埋，切片后HE染色，普通光镜下观察假体周围新生骨情况。

    1.5统计学分析：所有数据以x-±s表示，对照组与实验组的组间T检验，采用SPSS 12.0统计软件进行数据处理。

    2  结果

    2.1一般观察

    术后7 d动物可自由活动，未出现切口红肿、渗血渗液等情况，进食正常。

    2.2X线观察

    实验组术后4周缺损区内可见部分骨痂形成，与周围骨质分界清晰；8周可见大量模糊高密度骨痂影；12周缺损区已基本被高密度骨痂所填满，与周围骨质间分界变模糊，部分羟基磷灰石颗粒影消失，植入体位置良好，无脱落（图1）。对照组4周、8周无明显改变，12周仅边缘有少量的骨痂形成。  图1术后12周实验侧(左侧)成骨密度均匀，可见骨小梁形成，植入体位置好，对照侧(右侧)成骨不均匀，无骨小梁  图2扫描电镜（×1500） 术后12周实验组植入体表面空隙内充填大量类骨质  图312周组织学为成熟的骨组织（HE染色，×10）2.3扫描电镜：

    实验组术后4周植入体表面孔隙内少量骨基质沉积。8～12周可见明显的无定型的骨基质沉积（图2）。对照组各时间点植入体表面孔隙内，未见骨基质沉积。

    2.4  能谱分析

    不同时间点实验组较对照组内钙元素和磷元素的百分含量高，有显著性差异（P＜0.05）；随着时间的延长实验组和对照组内钙、磷元素百分含量都呈增大趋势，12周时钙磷元素百分含量虽较8周时有所增加，但差异无显著性（P＞0.05）；实验组内钙/磷比值随时间变化有逐渐增大趋势，8周时达高峰，12周较8周时有所降低；对照组内钙磷比值亦呈现增大趋势，12周时仍无减小趋势；对照组和实验组界面均含有大量C、O元素（表1）。 表1  植入体表面骨组织Ca、P（Wt%）与Ca/P 比值(x±s）n=5组别时间CaPCa/P实验组4周

　　2.5  组织学结果

    术后4 周实验组植入区内可见少许的新生骨组织形成, 中心部位亦有大量成骨细胞生长。术后8 周实验组在植入区内可见支架材料部分吸收, 遗留空间被新生骨组织取代, 骨缺损基本得到修复，部分区域新骨逐渐改建成熟, 在材料孔隙内出现板层骨样组织,。术后12周可见明显编织骨、板层骨及骨小梁形成，但仍可见到未吸收的羟基磷灰石颗粒（图3）。对照组各时间点均未见骨长入，缺损区仍为羟基磷灰石颗粒，仅边缘有少量新生骨组织。

    3  讨论

    假体-骨界面结合方式有两种学说,即骨整合及纤维性骨结合。骨整合为正常的改建骨和假体之间看不见软组织，假体与骨组织直接接触，其承受的负荷能通过这种直接接触，持续不断地传递并分散到骨组织中［1］。骨整合是成骨细胞首先在植入体表面黏附、丛集，然后在假体表面分泌骨基质，启动植入体表面上的新骨直接生成，新骨从假体表面逐渐向骨创面生长、延伸。假体-骨界面骨整合被认为是人工关节置换术后的理想状态。影响骨整合的因素有假体材料设计、固定方式、手术技术、局部血运、假体周围骨组织生物活性、细胞因子、激素、药物、微量元素等等。为了增加材料与骨组织之间的结合力，增加材料表面成骨细胞的黏附、迁移及分化，促进骨整合方法有二种：一是对假体材料进行一定的表面修饰，如喷沙、酸蚀、激光处理、电火花加工、离子溅射技术、体表面预湿等方法。生物材料表面生物活性物质涂层如羟基磷灰石，其作用机理是：可以改变原植入体的表面结构，增强植入体与骨的机械性结合；可以引导骨生长，加速骨沉积于植入体表面，缩短结合时间；可以阻止植入体金属离子释放；涂层提高改变植入体的机械强度，改善植入体的弹性模量。另一种方法是改变假体周围骨代谢，促进骨基质的形成。Lan等［2］研究证实rhBMP-2 在rhbFGF 和rhIGF-I的协同作用下可明显提高植入体周围骨整合的速率。王岩等［3］报告rhBMP-2可促进早期骨-假体界面的骨长入。薛恩兴等［4］报告接种自体骨髓细胞可加强涂碳灰石多孔钛植入物的骨整合。李亚非等［5］报告用BMP、红骨髓、异体骨复合即刻修复人工关节周骨缺损，可促进新骨形成。Breusch等［6］实验证实自体移植的成骨细胞和骨髓细胞对生物材料的骨整合具有骨诱导性作用。本研究应用骨髓间充质干细胞骨向诱导后与珊瑚羟基磷灰石复合修复假体周围骨缺损，结果表明骨髓MSCs骨向诱导后有促进骨整合的作用，特别是移植后的早期，这可能与局部为成骨细胞的迁移、黏附、增殖及分化提供了有利条件有关，或引入了细胞外基质的诱导活性有关。但假体周围早期骨长入是源于成骨细胞或引进的细胞外基质的诱导活性，尚有待于进一步研究。

    应用电子探针X线能谱分析可测量假体周围骨组织元素相对含量、元素比、元素组成和结构，能较好的反应假体和宿主结合界面的元素变化［7］。Guglielmotti等［8］研究表明X线能谱分析是检测金属表面骨性成份的有效方法。本研究不同时间点实验组较对照组内Ca、P元素的百分含量高，并呈增高趋势，8～12周达高峰期，表明骨髓MSCs移植组假体周围成骨活跃，基质分泌增高，有利于骨整合的形成。

    本实验扫描电镜观察示实验组术后4周植入体表面孔隙内有少量的无定形的均质的物质覆盖。8～12周植入体表面孔隙内可见明显的无定形的物质覆盖。这些物质可能是新骨所产生的类骨质，与植入体结合牢固。组织工程骨组Ca/P比值8周前逐渐增高，8周时达高峰，而后逐渐降低，表明假体-骨界面的骨矿颗粒是一种不定形的透明钙盐，8周后骨的改建逐渐变为活跃，12周时Ca/P比值为1.67，接近完全结晶的HA。文献报道材料的生物活性随Ca/P比值降低而升高。实验结果表明8周为新骨形成阶段，8周后为骨改建与骨成熟阶段，与组织学观察结果相符。

    总之，本研究通过实验观察了组织工程骨假体界面的生物学特性，结果表明骨髓MSCs可促进假体周围骨形成，有利于骨整合，为提高人工假体生存率的进一步研究提供了实验数据。

【参考文献】
  ［1］ Bin Z, Yingguang C, Yanxiang Y, et al. The evolvement of the theory of dental implant-bone interface［J］. Chin J Med, 2004, 4:170-172.

［2 ］ Lan J, Wang Z, Wang Y, et al. The effect of combination of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and basic fibroblast growth factor or insulin-like growth factor-I on dental implant osteointegration by confocal laser scanning microscopy［J］. J Periodentol, 2006，77:357-363.

［3］ 王岩，王松涛，崔健，等.重组人骨形态发生蛋白-2用于人工关节生物固定方法的研究［J］.中华外科杂志，2004，42:240-243.

［4］ 薛恩兴，徐华梓，彭磊.自体骨髓细胞增强多孔钛碳灰石涂层植入物在兔体内的早期骨整合［J］.浙江创伤外科，2007，12:3-7.

［5］ 李亚非，姚建华，常红星，等.组织工程方法异体骨复合物修复关节置换时骨缺损［J］.中国矫形外科杂志，2003，11：1520-1522.

［6］ Breusch SJ, Aldinger PR, Thomsen M, et al. Fixation principles in total hip arthroplasty. Part 1: femoral component［J］. Unfallchirurg, 2000, 103:918-931.

［7］ Lee IS, Whang CN, Lee GH, et al. Effect of ion beam assist on the information of calcium phosphate film［J］. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, 2003, 206:522-526.

［8］ Guglielmotti MB, Renou S, Cabrini RL. Evaluation of bone tissue on metallic implants by energy-dispersive X-ray analysis: an experimental study［J］. Implant Dent J, 1999, 8:303-309.

作者单位：第三军医大学附属大坪医院骨科，重庆市 400042