重组BMP4/7融合基因腺相关病毒的构建及其对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

【摘要】  ［目的］应用重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体（AAV BMP4/7）转染兔骨髓基质干细胞（BMSCs)，观察其对BMSCs生物学行为的影响。［方法］（1）采用RTPCR一步法和基因重组法，从胎盘组织中克隆BMP4和BMP7成熟肽cDNA，获取BMP4/7融合基因，克隆到质粒pGEM质粒中；（2）从pGEMBMP4/7质粒中切取BMP4/7融合基因克隆到穿梭质粒，在大肠杆菌内重组，在293细胞中构建AAVBMP4/7重组腺相关病毒载体；（3）不同MOI值的AAVBMP4/7转染兔BMSCs，观察细胞形态学变化，MTT法描记细胞生物曲线，观察对细胞增殖的影响，以AAVEDFP做对照；（4）AAVBMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后，行ALP及OC含量测定，观察成骨活性，以AAVEDFP做对照。［结果］（1）成功构建高滴度的携带BMP4/7融合基因的重组腺相关病毒AAVBMP4/7；（2）AAVBMP4/7转染BMSCs细胞后，细胞增殖活性良好，转染效率为72%，细胞形态呈典型的成骨改变，1×105 vg/cell的MOI值对细胞形态影响较小，而转染效率强于5×104vg/cell(59.38%)。（3）AAVBMP4/7转染细胞后，ALP、OC含量均明显增高，并与转染后诱导培养的时间呈正相关，与对照组比较差异统计学意义（tALP=896.88 P<0.001 tOC=543.24 P<0.01)。［结论］AAVBMP4/7融合基因转染效率高，对BMSCs细胞有明显的诱导成骨活性，对骨愈合的基因治疗提供了新的思路和途径。

【关键词】  骨组织工程； 骨形成蛋白； 融合基因； 腺相关病毒； 骨髓基质干细胞

    Construction of BMP4/7 fusion gene adenoassociated virus and biological effects of transfection on bone marrow stromal cells in rabbits∥YUAN  Shaohui, SHANG Jian, SHAO Guojun, et al. Orthopedical Department, the First Hospital of Harbin Medical University, Harbin, 150001,China

    Abstract：［Objective］To determine the biological effects of transfection of   adenoassociated rirus(AAV)  BMP4/7 on rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs).［Method］The mature peptide of BMP4 and BMP7  were gained by OneStep RTPCR from the human placenta and the BMP4/7  fusion gene was gained through  gene recombinant techniques and then transferred to pGEM plasmid. The BMP4/7  fusion genen was cut down from the pGEMBMP4/7 and the recombination was successfully completed in colibacillus, and  recombinant adenoassosiated was produced in 293 cells. Rabbit BMSCs were transfected with the recombinant adenoassosiated virus vectors carrying BMP4/7 fusion gene  with differen   multiplicitv of infection(MOI) values. Cell growth curves were drawn to evaluate the biologic effect of AAVBMP4/7 on cytoactivity. The transfection efficiency was measured using MTT method. The ossification of cells was evaluated by investigating the shape change of the cell ability of ALP and OC at 7,14 days after transfection. Cells were then transfected with AAVBMP4/7 and AAVEGFP,respectively.［Result］1.We successfully constructed the recombinant adenoassosiated virus with BMP4/7 fusion gene.2.The ttransfection efficiency of AAVBMP4/7  was roughly 72% without siginifficant biologic effect on cytoactivity.The ossification of cells was significant after transfection with AAVBMP4/7. The 1×105 vg/cell MOI value of transfection efficiency was stroger than 5～104 vg/cell MOI value (59.3,8%). 3. The concentrations of ALP and OC in AAVBMP4/7 transfection groups were significantbly higher than in AAVEGFP groups (tALP=896.88 P<0.001 toc=543.24  P<0.01).［Conclusion］The AAVBMP4/7 fusion gene can transfect rabbit BMSCs cultured in vitro at a high tansfection rate, and have significant ossification  activity.

    Key words：bone tissue engineering;  bone morphogenetic protein;fusion gene;  adenoassociated virus;  bone marrow stromal cells

    骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)具有诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)向成骨或成软骨细胞分化、促进新骨形成的作用。BMPs家族已发现20余种成员，以BMP2、BMP4、BMP7的活性最强，它们可促进软骨和新生骨形成。在促进骨及脊柱融合的实验中已取得了成功的经验［1］，其中BMP4，7均表现出不同的促进骨和脊柱融合的作用［2，3］。人体内BMPs多为同源二聚体，也存在少量的异源二聚体，如BMP2／7，  BMP4／7等。文献报道BMPs异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍［4，5］。

    腺相关病毒(adenoassiciaed virus，AAV)具有高效转染靶细胞，长期稳定表达外源基因及安全性好等特点［6］。本实验通过构建出融合基因BMP4／7的腺相关病毒载体(AAVBMP4／7)，观察AAVBMP4／7转染对兔BMSCs细胞生物学行为的影响，从而探讨BMP4／7融合基因是否具有促进兔BMSCs细胞成骨活性，为骨组织工程提供新的治疗思路。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    OneStep  RTPCR试剂盒(CLOTECH公司)，DNAMarker(大连宝生生物工程公司)，pGEMT，DMEM(哈尔滨弘博生物公司)，限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶(美国Promega公司)，PCR引物(上海Sigma生物制品公司)，碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(武汉博士德试剂公司)，骨钙素(OC)检测试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)，重组增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体(adeno associated virusenhancement green fluore scent protein，AAVEGFP)(本元正阳公司提供)。

    引物设计根据pGEMBMP4／7质粒为测序模板，用pGEM两侧特异的引物进行测序。

    1.2  实验方法

    （1）兔BMSCs的体外培养：取健康新西兰大白兔13只(由哈尔滨医科大学附属第一医学院中心实验室提供)，雄性，体重20 kg左右，2.5个月龄，按全骨髓法分离培养BMSCs，进行原代培养，待细胞汇合成单层后，消化传代，取生长状态良好的第3代细胞进行转染实验。

    （2）pGEMBMP4的构建及鉴定：根据Gene Bank中和hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoR I位点，下游引入BamH  I位点，从胎盘组织中，RTPCR一步法扩增BMP4成熟肽序列，将BMP4基因克隆入pGEMT载体中，获得重组质粒pGEMBMP4，然后用EcoR I和BamH I酶切pGEMBMP4质粒，回收酶切片断。T4连接酶16℃过夜，转化大肠杆菌，DH5α感受肽细胞，筛选阳性克隆，获得pGMEBMP4，EcoR I、BamH  I双酶切，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR引物扩增鉴定，以pGEM多克隆位点两侧特异引物进行测序，与Gene Bank中的BMP4成熟肽序列比对。

    (3)pGEMBMP7的构建及鉴定：根据Gene Bank中hBMP7的基因序列设计引物，上游引入BamH I位点，下游引入PstI酶切位点，同实验方法2步骤相同进行pGEMBMP7的重组质粒构建、转化、筛选、及相关的酶切1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR引物扩增鉴定，并进行测序。

    (4)AAVBMP4／7的构建及鉴定：采用DNA连接法将BMP4与BMP7基因片段连接，得到BMP4／7融合基因，经测序鉴定后，克隆到质粒pGEM。从pGEMBMP4／7质粒中切取BMP4／7融合基因克隆到穿梭质粒，在大肠杆菌内重组，在293细胞中构建AAVBMP4／7重组腺病毒。用EcoRI、BamH I Pst I酶切鉴定分析，将AAVBMP4／7质粒转化DH5α细胞，大量提取腺相关病毒质粒，取脂质体Lipofectamine 2 000,按说明书转染293细胞，G418筛选培养，获取抗约克隆细胞株。

    (5)AAVBMP4／7转染对细胞形态学的影响：取生长状态良好的第3代细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，接种到24孔板，每孔均匀接种105个细胞，培养至70％融合，进行病毒感染，实验按照AAV转染细胞感染复数(Multiplicit of infection,MOI)值，按梯度选取4组不同MOI值，分别为5×104 vg／cell，1×105 vg／cell，5×105 vg／cell，1×106 vg／cell,每组6孔，按不同的MOI值，将各孔所需要的病毒量及血清DMEM，加入各孔，转染2 h后，吸出病毒液，加入普通DMEM，常规培养，转染后每24 h观察细胞学改变。

    (6)AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响取MOI值为1×105 vg／cell的病毒转染兔BMSCs  (转染组)2 h，取未转染的BMSCs为对照组(非转染组)。将细胞消化收集后，按1×104／孔接种于96孔板，于接种后12、24、48、72、96h，行MTT法测定细胞活性(λ630 nm)，并描记细胞生长曲线，比较两组细胞增殖情况，观察AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响。

    (7)AAV病毒的转染效率：取生长状态良好的第3代细胞，以1×105 vg／cell MOI值转染2 h后，行流式细胞仪检测绿色荧光表达，计算细胞转染效率(实验重复6次)，5×104 vg／cell MOI值为对照。

    (8)AAVBMP4／7转染对细胞成骨活性的影响: 以AAVBMP4／7转染细胞2 h(实验组)后，培养7、14 d，在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变，观察成骨分化，以AAVEGFP为对照病毒，进行相应实验对照(对照组)(每组样本量为6份)。于转染后培养7、14 d，分别收集两组细胞上清液，按ALP检测试剂盒说明处理上清，比色仪测定(520 nm，1 cm光镜比色)，计算上清液中ALP的含量；另于转染后培养7、14 d，分别收集两组细胞上清液，按照试剂盒说明检测OC值，  收集细胞培养液100 μl，与125I标记的OC抗体100 μl混合后，4℃下放置24 h，加入分离剂混匀后，室温放置，  4℃离心弃去上清检测沉淀物放射剂量，计算各组平均OC含量。

    1.3  统计学处理

    应用SPSS 11.5统计学软件包进行分析，数据用±s表示，组间比较采用两组独立样本的t检验，P<0.05认为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  pGEMBMP4  及pGEMBMP7的构建与鉴定

    从阳性克隆中提取pGEMBMP4质粒及pGEMBMP7质粒，经双酶切后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定  和PCR引物扩增鉴定，分别可见374、451 bp亮带(图1，2)测序结果与Gene Bank中报道的BMP4基因和BMP7基因成熟肽序列完全符合。

    2.2  AAVBMP4／7的构建与鉴定   

    成功获得了AAVBMP4／7，经双酶切鉴定可见826 bp亮带(图3)，基因测序结果与Gene Bank中BMP4、 BMP7成熟肽基因序列一致，并成功在二者之间加入6个连接肽编码基因。经EcoR I、BamH I Pst  I鉴定和相应的PCR引物扩增，在琼脂糖凝胶电泳上，分别有374、451 bp的亮带，(图4)，说明成功获得了BMP4、BMP7的融合基因，重组产生了携带融合基因BMP4／7的腺相关病毒质粒。

    图1  BMP4重组质粒双酶切鉴定  图2  PCR产物及BMP7重组质粒酶切鉴定  图3  融合基因克隆载体鉴定  M：DNAMarker  1.PGEM／BMP4，PGEM／BMP7，融合基因  2.PCR片断  图4  PBV222／BMP4／7表达质粒酶切鉴定  1．丸DNA分子量标准  2．Eco RI与Pst I酶切质粒AAVBMP4／7  3．BamH I、Pst I切质粒AVVBMP4／7  4．Eco RI与BamHI酶切质粒AAVBMP4／7  5．BMP7PCR片断  6．BMP4PCR片断  M：DNAMarker

    2.3  AAVBMP4／7转染对细胞学形态学的影响

    以不同的MOI值分别转染兔BMSCs细胞，转染后24 h，各组均可观察到细胞形态变化，长梭形细胞收缩，  边缘不规则，72 h后上述改变明显，部分细胞失去BMSCs典型细胞形态，排列不规则，呈多角形或无规矩形。上述改变随着MOI值地增大而显著，5×104 vg／cell基本无明显变化，1×105 vg／cell变化较轻，1×106 vg／cell组影响最明显，部分细胞崩解(图5)。

    图5  AAVBMP4／7转染72 h后细胞改变  5a  5×104 vg／cell细胞无明显变化  5b  1×105 vg／cell变化明显，长梭形细胞收缩，边缘不规则  5c  5×105 vg／cell细胞进一步变化  5d  1×106 vg／cell部分细胞崩解(×200)2.4  AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响

    转染组和非转染组细胞于接种后12、24、48、72、96 h行MTT(λ=630 nm)法测定细胞活性，绘制生长曲线，结果表明两组细胞倍数增殖期均出现于24 h，转染组活性略低于未转染组，但细胞增殖活跃，提示AAV对细胞生长曲线的影响小(图6a、b)。   

    图6  AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响及转染BMSCs细胞的转染效率  6a  MOI值1×105 vg／cell转染  6b  MOI值5×104 vg/cell转染

    2.5  AAVBMP4／7转染效率检测

    取生长状态良好的第3代细胞，以MOI值1×105 vg／cell转染，流式细胞仪计算转染效率，平均转染效率为72％，MOI值时对细胞形态影响较小，而转染效率强于5×104 vg／cell(59.38％)。  (x2=15.58，P<0.01)(6b)。

    2.6  AAVBMP4／7对细胞成骨活性的影响

    (1)倒置相差显微镜观察：取AAVBMP4／7转染组及AAVEGFP转染组细胞，于转染后7、14 d，倒置相差显微镜观察，可见AVBMP4／7组于转染后7 d，细胞形态发生明显改变，起初细胞分布不均匀，出现局部密集，局部疏松，细胞呈多角形，高倍视野下可见胞浆内出现棕褐色颗粒，呈现明显的成骨改变。14  d后可见细胞呈复层生长，胞浆内棕褐色颗粒更加明显，可见细胞性钙结节形成。AAVEGFP组仅见细胞收缩，边缘不规则，无成骨细胞分化的特异改变(图7)。

    图7  AAVBMP4／7转染后倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化  7a  转染7 d细胞分布不均匀；扫现局部密集，局部疏松，细胞呈多角形，町见胞浆内出现棕褐色颗粒(×200)

    7b  转染14 d细胞呈复层生长，胞浆内棕褐色颗粒更加明显(×200)  7c  AAVEGFP转染组细胞无明显变化(×200)

    (2)ALP含量测定：取两组细胞转染后，7、14 d细胞上清液，计算ALP含量，AAVBMP4／7组分别为：67.2±8.4金氏单位，106.5±12.1金氏单位，AAVEGFP组分别为：10.1±2.7金氏单位，23.6±4.8金氏单位，两组间差异有统计学意义(t=896.88，P<0.001)   

    (3)OC含量测定：取两组细胞转染后7、14 d的细胞上清液，计算OC含量，AAVBMP4／7组分别为0.289±0.014 ng／ml，0.363±0.076 ng／ml；AAVEGFP组分别为0.011±0.007 ng／ml，0.017±0.010 ng／ml，两组间差异有统计学意义(t=543.24, P<0.01)。   

    3  讨  论

    BMPs在细胞生长及骨形成过程中扮演关键角色，一直被广大学者所关注［7，8］。在已发现的20余种BMPs中，BMP2、BMP4、BMP7的骨诱导能力最强，尤其是BMP4，新近的研究证实重组人BMP4促进脊柱融合的作用强于重组人BMP2,所需剂量仅为重组BMP2的1／10，且成骨量与剂量呈正相关［9，10］。由于BMPs在体内异源二聚体活性高于同源二聚体，故本实验在目的基因的选择上，选择了BMP4与BMP7，将二者成熟肽序列成功克隆，利用DNA重组技术将BMP4、BMP7成熟肽基因融合，将融合基因成功克隆到穿梭质粒，在大肠杆菌内重组，获取AAVBMP4／7质粒，在293细胞中成功稳定表达，为进一步研究异源二聚体BMP4／7对骨髓基质干细胞是否具有促进骨形成的作用打下实验基础。

    AAV基因组可以整合入宿主细胞的基因组DNA中，保证了外源基因长期稳定表达。AAV末端重复序列中的转录元件方向不指向宿主DNA，插入突变的可能性很小。该病毒载体还可整合入分裂及非分裂期细胞，宿主范围较宽［11，12］，因而在应用基因工程技术解决重组基因获得持续表达的问题中，AAV可作为较合适的病毒载体，是目前基因治疗基础和临床研究中最常用的载体之一。

    目前文献中报道AAV转染细胞的MOI值差异很大，从1×104～1×106 vg／cell,均有报道［12，13］。本实验通过采用不同梯度的MOI值转染细胞发现，1×105 vg／cell对细胞形态影响较小，对细胞增殖活性无明显影响，转染效率为72％，明显高于文献中报道的脂质体感染率20%～30％。有学者报道5×104 vg／cell即可达到良好的转染效率(55%～65％)，对细胞增殖活性影响也较小［14］。本实验结果认为，1×105 vg／cell MOI值转染效率高于5×104 vg／cell MOI值，前者可作为常规选取的MOI值，既保证了一定的转染病毒量，同时也保证了良好的转染效率，经统计学分析，与文献［14］报道的转染效率间差异无统计学意义(P>0.05)。

    BMSCs属成骨干细胞，是具有向多种细胞系转化潜能的基质干细胞，在一定外界环境及刺激因子的作用下实现跨系统分化，具有取材方便，易培养等特点，是组织工程良好的种子细胞来源［15］。本实验应用AAVBMP4／7转染BMSCs，相对于对照组，细胞形态由梭形细胞向多角形、立方形转化，呈现明显的成骨改变，随着转染时间的延长，上述特征性改变更加明显，说明BMP4／7融合基因有成骨活性，与转染时间成正相关。

    研究表明，BMPs在骨发生的过程中主要起3个作用：促进细胞的趋化、有丝分裂和细胞分化。BMSCs分化为成熟的成骨细胞的复杂过程，是由于许多的系统因子、旁分泌因子和自分泌因子的相互作用完成的。在培养的BMSCs中加入BMPs进行诱导，成骨细胞的过程被诱发时，向成骨细胞分化的重要表现是细胞合成分泌表达成骨特征性蛋白和细胞外基质成分，如碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)是常用的检测指标。细胞形态学观察显示，AAVBMP4／7转染细胞诱导培养后的7、14 d细胞呈现成骨活性，且活性逐渐增强，而对照组AAVEGFP未见明显的成骨活性。AAVBMP4／7转然后诱导培养7、14 d,细胞上情液中ALP、OC的含量均明显增加，并随着诱导培养时间的延长而递增，  AAVEGFP对照组ALP、OC的含量无明显增加，结果证实了通过AAV转染的BMP4／7融合基因有诱导成骨活性，说明BMP4／7融合基因有生物学活性。

    综上，本实验成功将BMP4、BMP7连接并构建了融合基因BMP4／7，通过AAVBMP4／7转染BMPSs，初步探讨了AAVBMP4／7对靶细胞生物学行为的影响，结果表明，BMP4／7有生物学活性，可通过AAV在靶细胞内高效表达，可加速BMSCs向骨表型转化，促进骨形成。本实验为骨组织工程的基因治疗提供了一个新的思路，为尝试用BMPs的融合基因有效提高成骨活性，提供实验研究基础。

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作者单位：（哈尔滨医科大学附属第一医院骨一科，哈尔滨 150001）