无定形磷酸钙负载rhBMP2纳米缓释体的生物相容性及安全性

【摘要】  ［目的］观察无定形硫酸钙(ACP)负载重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2/ACP)纳米缓释体的生物相容性及安全性,为新型材料的临床应用提供必要的实验依据。［方法］对材料分别进行体外溶血实验、微核实验、急性毒性试验、热原试验、皮内刺激反应实验和短期肌内埋置试验、骨内植入实验。［结果］材料浸提液对兔血无溶血现象，对小鼠骨髓细胞无遗传毒性作用，未引起小鼠急性毒性反应、兔热原反应、兔皮内刺激反应；兔短期肌肉埋置、骨内植入后局部无明显炎症反应、无组织坏死，材料逐渐发生降解，能与组织有机融合。［结论］rhBMP2/ACP纳米缓释体的生物相容性及安全性符合ISO10993、GB/T16886规定的体内植入物的生物学评价标准，可作为骨修复替代材料用于相关疾病的临床治疗。

【关键词】  重组人骨形态发生蛋白； 无定形硫酸钙； 生物相容性

Experimental study on the biocompatibility and security of a rhBMP2 loaded amorphous calcium phosphate delayed release nanosized material∥WANG Haoyu, WU Xiaotao, ZHANG Shaodong, et al. Department of Orthopedics, Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing, 210009, China

    Abstract：［Objective］To study the biocompatibility and security of the recombinant human bone morphogenetic protein2(rhBMP2) loaded amorphous calcium phosphate (ACP) delayed release nanosized material and investigate the feasibility of the clinical use as a kind of bone substitute in bone engineering.［Method］The in vitro hemolyzation, cytotoxicity, microkernel test in marrow smear, acute systemic toxicity, pyrogenicity, subcuticular stimulation reaction and shortterm intramuscular implantation, as well as endosseous implantation were performed on the rhBMP2/ACP delayed release nanosized material.［Result］The materialextracted liquid induced no hemolyzation, no toxic effects of genetic ,no pyrogenic reaction in rabbits, no cytotoxicity cultured in rabbit bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs) in vitro and no acute toxicity in mice. The intramuscular implantation and endosseous implantation in rabbits induced no inflammatory reaction, tissue necrosis and the material was degraded gradually, fused organically with tissues.［Conclusion］The biocompatibility and security of the rhBMP2/ACP delayed release nanosized material could meet the requirements given in biological standards for implanted biomaterials ISO10993 and GB/T16886, suggesting that it could be a good bone substitution for the clinical trial.

    Key words：rhBMP2;  amorphous calcium phosphate;  biocompatibility

     在各类创伤造成的骨缺损修复中，植骨材料的选择一直是临床重视的问题。随着生物材料的迅速发展，具有良好生物活性的支架材料负载一定量的生物活性因子形成的骨修复替代材料成为近年研发的热点之一。作者采用无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate, ACP）负载重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein2, rhBMP2）制备的纳米缓释体兼容了ACP良好的生物活性、细胞黏附性、细胞相容性［1］和rhBMP2良好的诱导成骨作用［2］，能满足支架材料可控的生物降解速率和优异的骨传导性能，缓释体中的rhBMP2符合双向动力学释放规律，且有良好的缓释效果［3］。本文在前期试验的基础上，综合评价rhBMP2/ACP纳米缓释体的生物相容性及安全性。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料试件制备

    　　在ACP原制备技术基础上［3,4］，模拟自然骨组织成分和微结构设计，以湿化学法合成制备rhBMP2/ACP纳米缓释体实验材料(以下简称实验材料)，并将其预制成直径2 mm，高为6 mm圆柱体标准试件，聚乙烯塑料袋双层密封包装，经60Co 25 kGy辐射灭菌后备用。

    1.2  实验材料浸提液制备

    　　取实验材料固相粉末12 g，经60Co 25 kGy辐射灭菌后，浸入盛有120 ml生理盐水的无菌容器中，37℃静置浸提10 d，取其上清液移入无菌玻璃容器内密封备用。

    1.3  溶血试验

    常规心脏穿刺抽取新西兰兔血10 ml，即刻加入20 g／L草酸钾0.5 ml混合抗凝，取抗凝兔血8 ml加入10 ml生理盐水中稀释备用。实验分为3组，每组各3管,每管加入0.2 ml稀释兔血,再分别于实验材料组加入材料浸提液10 ml,阴性对照组加入生理盐水10 ml,阳性对照组加入双蒸水10 ml。全部试管37℃水浴1 h,肉眼观察有无溶血, 2 000 r／min离心5 min，取上清液，在分光光度计545 nm处测定吸光度值,各组取均值计算溶血度。溶血度％＝（实验材料的吸光度－阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度－阴性对照吸光度）×100%,溶血度>5 ％ 为阳性反应，表示有溶血现象。

    1.4  微核试验

    　　取清洁级密封群健康成年昆明小鼠12只，雌雄各半，体质量20～25 g，均衡性别后随机分为3组，实验组和阴性对照组分别以0.05 ml/g体质量剂量腹腔注入材料浸提液或生理盐水，阳性对照组以0.04 mg/g体质量剂量腹腔注入环磷酰胺，间隔24 h给药1次共4次，于末次给药后6 h处死实验鼠，常规提取胸骨髓制作涂片，Gimsa染色，每只小鼠观察1 000个嗜多染红细胞中微核细胞数，计算其发生率。

    1.5  急性毒性试验

    　　取健康成年昆明小鼠12只，雌雄不限,体质量20～25 g，随机分为两组，序列编号。实验组以0.05 ml/g体质量剂量腹腔内一次性注入材料浸提液,对照组同剂量注入生理盐水。记录24、48、72 h小鼠体质量变化，14 d内小鼠的呼吸、进食、运动等一般情况及不良反应或死亡等。

    1.6  热原试验

    　　取健康成年新西兰兔6只，雌雄不限，体质量为2.2～2.4 kg，序列编号。材料浸提液注入前0.5、1 h各测肛温1次,取均值为正常值。将材料浸提液以5 ml/kg体质量剂量自兔耳缘静脉缓慢注入，每间隔1 h测量肛温1次，共3次，记录各兔体温值。体温升高值为3次体温最高值减去正常值。

    1.7  皮内刺激反应实验

    　　取健康成年新西兰兔3只，雌雄不限，体质量为2.0～2.4 kg。于实验前1 d备皮，在兔背部脊柱两侧脱毛。常规消毒后于兔脊柱一侧有序排列的5个点上皮内各注射0.2 ml浸提液，在对侧对应点注射0.2 ml生理盐水。注射后观察并记录即刻、24、48、72 h各时相点各注射部位的红斑和水肿状况。在各时相点将各兔观察点出现的红斑和水肿的原发性刺激记分相加，再除以观察点总数为试验材料原发性刺激记分。将试验材料试点原发性刺激记分减去对照液试点记分得出每只兔原发性刺激记分。以各时相点观察记录数据计算原发性刺激指数。

    1.8  肌内埋置实验

    取同窝同系健康成年新西兰兔6只，雌雄各半，体质量2.0～2.4 kg，以3%戊巴比妥钠1 mg/kg股部肌注麻醉，兔背部脊柱两侧依次按上下左右各做长约2 cm小切口4个，分层达筋膜，在肌肉内钝性分离形成肌袋，将无菌材料试件植入肌袋，逐层缝合切口。术后分笼饲养，观察实验兔术后一般情况。于术后1、2、4周分别处死2只实验兔，切取植入区组织块，大体观察有无水肿、化脓、材料排出等,并制作标本切片,HE染色，光镜下观察炎性反应和纤维包膜形成情况。

    1.9  骨内植入实验

    　　取同窝同系健康成年新西兰兔6只，雌雄各半，体质量为2.0～2.4 kg，术前1 d脱毛。3%戊巴比妥钠兔耳缘静脉注射麻醉后，常规切开股骨外侧肌肉，分离暴露股骨中段，用消毒牙钻在股骨骨面上钻孔至髓腔，孔径为2.2 mm，每侧股骨钻孔2个，将无菌实验材料试件植入孔内，凝固后骨蜡止血，封闭试件与孔之间的缝隙。逐层缝合切口，放回笼内单独饲养，观察实验兔术后一般情况。于术后2、4、12周各处死2只，取出股骨全段，系列脱钙制作标本切片, HE染色，光镜下观察成骨和材料降解情况。

    1.10  统计学方法

    采用SPSS 10.0统计软件处理，数据用均数+标准差(±s)表示，单因素方差分析,P<0.05有统计学意义。

    2  结果

    2.1  溶血试验

    　　实验材料对健康兔血的溶血度平均值为1.59% (表1)，低于标准规定的5%，可认定实验材料无体外溶血作用。 表1组别试管1试管2试管3平均值溶血度

    2.2  微核试验

    　　各组小鼠胸骨髓涂片中出现微核的嗜多染红细胞的发生率分别为，实验组雌性鼠0.02%、雄性鼠0.03%，阴性对照组雌性鼠0.03%、雄性鼠0.04%，阳性对照组雌性鼠2.16%、雄性鼠2.22%；实验组微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。实验组、阴性对照组与阳性对照组比较两组差异均有统计学意义（P<0.05），表明材料浸提液对小鼠骨髓细胞无遗传毒性作用。

    2.3.急性毒性试验

    实验组与对照组各小鼠体质量均呈上升趋势,两组在24、48、72 h 3个时间段内体质量无显著性差异(P>0.05)(表2)；14 d内无小鼠死亡，活动、进食、排泄正常，未见步态不稳、惊厥、瘫痪及呼吸抑制等毒性反应。急性毒性剂量分级为无毒级，表明受试材料对昆明小鼠无急性全身毒性。

    2.4  热原试验

    6只新西兰兔经热原试验后，3次体温测量个体体温升高最高为0.27℃,均低于0.6℃，3只组合体温升高总和最高为0.57℃，均在评价标准值1.4℃以内（表3），表明受试材 料不含致热原物质。表224 h48  h72 h实验组

    2.5  皮内刺激反应实验

    　　实验点和相对应对照点24、48、72 h时限点均未见皮肤红斑、水肿、溃疡等反应；原发性刺激评分为0，原发性刺激指数为0，表明受试材料无皮肤刺激作用。

    2.6  肌内埋置实验

    　　术后动态观察，实验兔一般情况好，植入区均无红肿、渗液、感染，切口愈合良好。各时间点标本均无化脓、肌肉坏死、植入物排出现象。组织学观察，术后1周组肌袋有少量炎细胞浸润，以中性粒细胞和散在的淋巴细胞为主，无组织坏死，无纤维组织包绕，有成纤维细胞形成（图1）；术后2周组肌袋仍有极少的中性粒细胞和偶见的淋巴细胞，以及少许巨噬细胞和异物巨细胞浸润，材料外缘可见被降解的细小材料颗粒，植入物周围组织形态正常，有稀疏的纤维膜包绕，但包膜形态不完整，成纤维细胞增生明显；术后4周组肌袋未见炎细胞浸润，植入物部分降解吸收并被微薄且透明的纤维膜包裹，包膜细胞成分主要是纤维母细胞。异物巨细胞较2周组明显减少, 材料降解现象明显，材料与肌肉之间有新生软骨形成(图2)，表明受试材料与肌肉组织相容性良好。

    2.7  骨内植入实验

    植入术后观察，实验兔切口均为I期愈合，无窦道，无排斥反应；术后2周时，植入材料被由BMSCs分化来的软骨样细胞和软骨样组织分割包绕，与骨面之间有小间隙存在；术后4周时，软骨细胞和软骨组织逐渐成熟形成新骨，植入材料与受体骨嵌合紧密，新生骨痂组织蔓延材料面，部分骨细胞已长入材料间隙中，材料颗粒降解、融合，失去原有的均匀结构，与骨交界处有细胞分化现象(图3)；术后12周时，植入材料与骨组织间无间隙，有骨小梁长入，材料周围可见纤维、血管构造丰富的哈佛氏管和未钙化的软骨组织，材料与骨界面为骨性结合。切片显示，材料表面已呈现出吸收和降解形成的特有孔隙，内有骨细胞存在,表明实验材料与骨组织之间有良好的相容性。

    图1  1周肌袋有少量炎细胞浸润，无组织坏死，无纤维组织包绕，有成纤维细胞形成  图2  4周肌袋未见炎细胞浸润，植入物部分降解吸收并被微薄且透明的纤维膜包裹， 材料降解现象明显，材料与肌肉之间有新生软骨形成  图3  4周时，植入材料与受体骨嵌合紧密，新生骨痂组织蔓延材料面，部分骨细胞已长入材料间隙中，材料颗粒降解、融合，失去原有的均匀结构，与骨交界处有细胞分化现象

    3  讨  论

    　　良好的生物相容性和安全性是骨修复替代材料发挥骨引导或骨诱导作用的前提。临床对于植入型骨修复替代材料除应评价其理化特性、生物力学性能外，尚须探讨材料的生物降解与功能细胞之间的生物相容性，以及材料与骨组织之间的相互作用、成骨机制等功能性评价，而评价的主要手段是体外和体内试验。基于评价标准和要求，本研究通过体外与体内的相应试验综合评价rhBMP2/ACP纳米缓释体的生物相容性和安全性。

    评价生物材料生物相容性的体外实验，主要观察受试材料或浸提液对组织细胞生长、增殖及代谢的影响。本实验的前期工作［3］采用原代培养的BMSCs，体外分离培养方法简便,扩增速度快, 能准确体现受试材料与体内细胞作用的真实情况,较其他组织细胞或多次传代后功能表达下降的建系细胞更为灵敏可靠。BMSCs是具有较强成骨潜能的干细胞，其在材料表面的贴附、铺展、分化是促进新骨形成的基础。作为骨组织的重要功能细胞，承负着骨的修复与改建功能，因而BMSCs细胞接种在骨植入材料表面的形态及功能变化，客观反映着材料的细胞相容性。前期实验［3］显示，原代培养细胞贴壁紧密，伪足伸展良好，传代后呈集落化生长趋势；复合培养中RGR、ALP活性检测结果表明，实验材料对BMSCs的黏附、增殖、分化和分泌基质无不良影响，说明受试材料具有良好的细胞相容性。有研究认为BMP需借助适宜载体才能发挥异位成骨能力，ACP可以满足人体细胞对载体的多重要求［5］。本实验观察发现，BMSCs能在实验材料表面附着并伸展、繁殖、分泌细胞外基质，表现出明显的诱导成骨功能，证实ACP作为生长因子的载体具有促进多能干细胞表达成骨细胞表型及合成细胞外基质的功能，是一种有效的骨诱导因子和间充质细胞体外扩增的载体，rhBMP2能在ACP 协同下诱导未分化的BMSCs向成软骨细胞和成骨细胞分化。rhBMP2/ACP纳米缓释体进一步表现出其不具细胞毒性和较高的细胞粘附性，能明显促进细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性，其负载的rhBMP2能维持有效生理浓度在局部缓慢释放并持续表达［3］，保持了良好的促成骨因子生物活性,在诱导成骨的同时促进了材料的降解。

    体内植入试验是对受试材料体内变化的阶段性组织学检查，着重观察材料周围组织的病理改变及材料的降解情况，是目前国际通行的评价生物材料对组织毒性刺激反应的有效方法。通常以炎性细胞浸润和材料表面包膜形成两方面进行评价。本实验兔肌内埋置和骨内植入观测结果，材料植入局部均无明显的组织毒性刺激反应，且有诸多迹象表明受试材料能够逐步降解吸收并被机体组织替代。肌内埋置早期材料周围组织出现少量炎性细胞局部浸润,但炎性指数随时间延长逐渐回落消失,其炎性变化为一过性，符合术后正常应激反应的转归规律；后期尚有少许异物巨细胞浸润可能与材料的持续崩解、巨噬细胞吞噬和胞外降解吸收等产生的异物刺激有关；材料溶解产生的激肽类物质是包膜形成的主要原因，当钙、磷等离子减少到一定程度，即纤维包膜形成稳定后不会再继续增厚［6］。BMSCs作为多能干细胞有多种分化的潜能，但其分化并非是一个完全自发的过程。体内环境及某些细胞因子对其分化有一定的促进作用［7］，构建局部微环境的基质材料是BMSCs附着的框架和细胞代谢的场所，其形态与功能直接影响着BMSCs的附着、增殖、迁移和分化。ACP球形纳米颗粒与微观结构，以及较低的表面粗糙度，不但为BMSCs附着提供了更多的表面附着位点，为其行使功能建立了适宜的三维空间，而且增加了材料对rhBMP2的吸附能力，延长了活性因子的释放时间。ACP通过对rhBMP2的控释作用，使BMSCs能在生长因子的调控下增殖、分化，促进了新骨形成。兔骨内植入观察发现，2周时即有软骨样细胞和软骨样组织形成；4周时材料与骨组织已呈现出骨性结合，骨组织渐趋成熟，表现为骨小梁和骨岛初步成形，骨陷窝和骨组织形态与正常骨组织结构基本一致；12周时可见较为典型的骨小梁及骨髓结构,材料的降解与成骨代谢活性逐渐加强，材料表面呈现快速吸收降解状态，骨组织与材料界面为骨性结合，材料降解速率与新骨形成接近天然骨正常的重建过程，说明受试材料可与受体骨发生牢固生物键合。哈佛氏管的出现是造骨系统高代谢功能的表现,表明新生骨生长迅速。本实验若在时间设计上适当延长可能更有利于对纤维包膜增长规律和骨组织学改变的观测。

    　　本研究通过系列实验检测，参照ISO10993和GB/T16886对生物医学材料评价的相关标准判定，rhBMP2/ACP纳米缓释体在实验设定的时间内无毒，不含热原物质，不引起溶血反应和皮内刺激反应；肌袋植入组织学观察材料周围组织无异常改变，无材料排除；骨内植入后材料逐渐发生降解，形成的新骨能与组织有机融合。表明rhBMP2/ACP纳米缓释体具有良好的生物相容性和安全性，是一种较为理想的生物活性因子载体材料和释放系统。可试用于骨缺损修复的治疗，进一步研究和探索其临床应用的可能性。

【参考文献】
  ［1］ Gao Y, Weng W, Cheng K, et al. Preparation, characterization and cytocompatibility of porous ACP/PLLA composites［J］. J Biomed Mater Res, 2006, 79:193-200.

［2］ Hoshino M, Egi T, Terai H, et al. Repair of long intercalated rib defects using porous betatricalcium phosphate cylinders containing recombinant human bone morphogenetic protein2 in dogs［J］. Biomaterials, 2006, 28:4934-4940.

［3］ 王皓宇，吴小涛，张绍东，等.无定型磷酸钙负载rhBMP2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验［J］.中国矫形外科杂志，2008，7：515-518.

［4］ Li YB, Wiliana T, Tam KC. Synthesis of amorphous calcium phosphate using various types of cyclodextrins［J］. Materials Research Bulletin, 2007, 5:820-827.

［5］ Dion A, Berno B, Hall G, et al. The effect of processing on the structural characteristics of vancomycinloaded amorphous calcium phosphate matrices［J］. Biomaterials,2005,21：4486-4494.

［6］ Li DJ, Katsuichior O.Thickness of fibrous capsule after implantation of hydroxyapatite in subcutaneous tissue in rats［J］. J Biomed Mater Res, 1999, 45:322-326.

［7］ Kawabata K, Sakurai F, Koizumi N, et al. Adenovirus vectormediated gene transfer into stem cells［J］. Mol Pharm, 2006, 3:95-103.

作者单位：1.东南大学附属中大医院骨科,南京; 2.南京工业大学材料学与工程学院,南京; 3.苏州大学附属第一医院骨科，苏州；4.东南大学医学院附属蚌埠第三医院骨科，蚌埠