Smad3与骨修复

【关键词】  Smad3 骨修复

骨修复是间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞，并合成胞外基质，不断钙化、骨化的过程。随着细胞生物学和分子生物学的发展，骨修复的机制研究取得了进一步进展。现已明确，多种细胞因子参与了骨修复，其中，转化生长因子β(transforming growth factor，TGFβ)是一个具有争议的因子。早期研究表明外源性TGFβ可诱导骨形成［1］，随后学者却发现过表达TGFβ的转基因小鼠模型出现骨质疏松［2］。近年来的研究显示TGFβ可抑制间充质干细胞向成骨细胞及软骨细胞分化，并能抑制成骨细胞胞外基质的合成。进一步研究表明，Smad3在TGFβ的这一作用中起重要作用。本文就此作一简要综述。

    1  Smad3基因的生物学特点

    Smad3基因属于Smad基因家族成员之一，定位于15q21-22，含有9个外显子和8个内含子，转录片段全长约5.7 kb。Smad3在哺乳动物的不同种属中具有高度保守性，其基因产物是TGFβ信号通路中的细胞浆成分，具有3个功能域，即MH1、MH2区和L区(图1)。

    图1  Smad蛋白结构域及其功能

    MH1区含有一个由11个氨基酸构成β发卡环，可与Smad结合元件(smad binding elements，SBE)，即“CAGACA”序列特异性识别并结合。在β发卡环附近具有一个，折叠-2，可协助Smad3、SBE的结合。MH1区中还含有核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，与Smad3核积聚密切相关。

    MH2区含有L3环和α折叠-1，能与TGFβ Ⅰ型受体特异性结合。一旦与受体结合，MH2区特征性结构SerSerXSer(SSXS模体)中的丝氨酸残基将发生磷酸化。磷酸化位点位于后2个Ser，尽管第1个Ser不是磷酸化位点，但它可介导后2个位点Ser的有效磷酸化［3］。Smad3、SBE的结合需要该模体磷酸化。此外，MH2区还介导Smad3、Smad4、DNA转录因子结合，如组蛋白去乙酰酶(histone deacetylases，HDAC)、CBP／P300。

    L区位于MH1、和MH2区之间，起连接作用。该区与Smad3／Smad4形成有关。而且L区尚具有转录激活功能，L区缺失的Smad3蛋白虽然可以被TGFβ激活，但是不能介导TGFβ的转录激活功能［4］。

    2  Smad3、TGFβ信号传递

    TGFβ受体分为Ⅰ、Ⅱ型，具有丝-苏氨酸激酶活性［5］，可在TGFβ作用下相继活化。活化的Ⅰ型受体与Smad3蛋白MH2区结合，使其SSXS模体磷酸化，促进Smad3与胞质中的Smad4结合。同时，磷酸化的Smad3空间构象发生改变，NLS基序暴露，与核转运载体结合，使Smad3／Smad4复合物发生核转移。进入核内的Smad3与核心结合因子(corebinding factoral，CBFA1)结合，尽管后者仍可与成骨细胞特异元件2(osteoblastspecific element 2，OSE2)，即“5‘-CCAACCAC-3’”序列结合［6］，但Smad3／CBFA1复合物增强了Smad3分子MH2区结合Ⅱa类HDACs如HDAC4、HDAC5的能力，从而导致OSE2区的组蛋白3、4去乙酰化，使该区核小体结构紧缩，抑制下游基因的转录［7］。事实上，Smad3还可与具有内在组蛋白乙酰化活性的转录因子如CBP／P 300结合，降低组蛋白对转录的抑制，激活下游基因转录［8］。因此，Smad3本质上相当于一个与组蛋白乙酰化／去乙酰化酶结合的平台，其转录激活或者抑制作用取决于该平台具体与何种酶结合。OSE2作为启动子存在于多种与骨修复相关的基因上游，如骨钙蛋白(osteocalcin，OC)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等。靶基因转录后，Smad3从染色质释放，并从核内转至胞浆，并被26S蛋白酶或泛素蛋白酶降解［9］。

    图2  Smad3与TGF-β信号传递示意图

    3  Smad3与骨修复

    众所周知，膜内成骨和软骨内化骨是骨修复的两条基本途径，二者均始于间充质干细胞的分化，并最终由分化过程中的细胞完成胞外骨基质的形成。作为TGFβ的胞内信号分子，Smad3在骨修复中的作用一方面是抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，并且减少成骨细胞胞外基质的合成；另一方面是抑制软骨细胞的肥大成熟，使骨修复延长。

    3.1  Smad3在TGFβ抑制成骨细胞分化中起重要作用

    TGFβ在骨修复过程中具有重要作用［10］。骨折早期，骨细胞不能合成TGFβ，断端汇集的TGFβ主要由血小板释放，外加断端骨基质中的TGFβ前体释放和活化，导致局部TGFβ浓度逐渐升高。在TGFβ的作用下，间充质干细胞发生增殖反应，随后在骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)的作用下向成骨细胞分化。Shingo等的研究表明，TGFβ可抑制间充质干细胞向成骨细胞的分化，这一作用由TGFβ的胞内信号分子Smad3介导［11］。实际上，TGFβ首先激活间充质干细胞内的Smad3分子，后者进入核内与CBFA1、Ⅱa类HDACs形成复合物，抑制骨钙蛋白和cbfal蛋白基因的转录，从而阻碍间充质干细胞向成骨细胞分化。但Smad3对成骨细胞分化的抑制作用依赖于后者的分化阶段，Smad3仅能对间充质干细胞起始的分化具有抑制作用，而对分化至后期的细胞没有抑制［12］。另一方面，Anita等人研究发现Smad3基因缺失小鼠真皮成纤维细胞因BMP活性增强而具有成骨细胞特性，提示TGFβ、BMP信号之间相互拮抗［13］。Shen等的研究也证实了这一点，并认为TGFβ通过调节Smad6等蛋白拮抗BMP的作用［14］。此外，TGFβ与BMP之间的拮抗还可以从Smad4分子的竞争解释。前已诉及，由TGFβ激活的Smad3进入细胞核前需与胞质中的Smad4结合，而Smad4也是BMP信号途径中的中介［15］，因此，TGFβ还可通过激活Smad3竞争Smad4来减少BMP信号，从而达到抑制间充质干细胞分化的目的。骨折初期TGFβ增加，其目的在于促进间充质干细胞的增殖，同时对单核细胞、成纤维细胞具有趋化以及诱导分泌作用，使炎症细胞在伤口部位大量集聚，分泌各种细胞因子，合成胶原等基质，促进成骨细胞的长入，从而间接促进骨修复。但过多的TGFβ对间充质干细胞分化又具有持续抑制作用，这种抑制作用一旦超过BMP的诱导作用便可导致骨修复延迟的发生。这可能是炎症导致骨折不愈合的原因之一。

    3．2  Smad3在TGFβ抑制成骨细胞基质合成中起重要作用

    TGFβ不仅能够通过Smad3抑制成骨细胞分化，还可影响骨基质的成分和机械性能，而Smad3在其中仍发挥其胞内信号分子的作用。Shingo的研究表明Smad3被TGFβ激活后可抑制成骨细胞合成骨钙蛋白等胞外基质成分［16］。作为骨基质中最丰富的非胶原蛋白，骨钙蛋白与骨基质的矿化有关。Roy等人研究证实骨钙蛋白与骨基质钙磷比、微观结构以及骨弹性模量、硬度均有关系［17］。因此，Smad3还可通过抑制骨钙蛋白的表达来影响骨基质的矿化。Guive等人进一步采用5种具有不同TGFβ／Smad3信号量的转基因小鼠模型，发现随着TGFβ／Smad3信号的增强，小鼠胫骨弹性模量和硬度均显著减低，并且存有剂量效应。鉴于胫骨的发生是通过软骨内成骨形成，Guive等人又改用膜内成骨形成的颅骨进行检测，获得相同的结论［18］。说明TGFβ／Smad3信号的减弱可以改善2种成骨方式的骨机械性能参数，而骨修复同样基于这2种成骨方式，因此可以推断，TGFβ／Smad3可通过抑制骨基质合成来阻碍骨修复。在对5种模型骨基质的分析中，Guive等人又发现，除2个月龄Smad3基因缺失小鼠外，TGFβ／Smad3信号仍与小鼠胫骨无机盐含量呈负相关，这与Borton等人的研究结果相同［19］。但这并不能说明Smad3基因缺失抑制成骨过程，因为Smad3基因缺失小鼠的免疫、消化和内分泌发育不全，小鼠出生时骨基质无机成分尚较野生型小鼠增多，而在出生后逐渐减少，说明这种骨量的改变是由上述系统发育不全所致。此外，Guive等人还发现随着TGFβ／Smad3信号的增强，转基因小鼠股骨的断裂韧度显著降低，这与弹性模量以及强度的结果一致。同时，TGFβ／Smad3信号减弱的小鼠显示出骨折裂纹偏转。说明TGFβ／Smad3信号减弱可以改善骨的机械性能。膜内化骨实质是成骨细胞分化、并分泌胞外基质骨化的过程，而Smad3作为TGFβ的信号分子既可抑制成骨细胞分化，又可减少骨基质的合成，因此可以认为Smad3可抑制膜内化骨过程。

    3.3  Smad3在TGFβ抑制软骨肥大分化中起重要作用

    骨折后断端原始骨痂的形成不仅通过膜内化骨，还可通过局部纤维组织向软骨组织转化，并随软骨细胞的增生、肥大、钙化而骨化形成桥梁骨痂。Smad3对这一过程中软骨细胞肥大分化也有一定的抑制作用。Xiao等人发现TGFβ／Smad3信号可抑制软骨细胞肥大变性，保持关节软骨细胞的功能，防止关节炎的发生［20］。Jun等人的研究也证实了这一结论［21］。事实上，关节软骨在缺乏TGFβ刺激时，BMP活性增强，软骨细胞肥大分化为骨细胞，即导致关节炎的发生［22］。而在骨修复过程中软骨细胞肥大分化为骨细胞是桥梁骨痂形成的一个必要条件。因此Smad3可通过抑制软骨细胞分化延缓骨痂形成，从而影响骨修复。对于Smad3基因抑制软骨细胞分化的机理尚不明确。Zheng等人研究证实Smad3对软骨细胞肥大分化的抑制有赖于CBFA1的作用［23］。Wang等人采用基因芯片对Smad3基因缺失小鼠软骨细胞分析表明Smad3可能通过影响蛋白合成相关基因和呼吸链相关蛋白基因合成来抑制软骨细胞分化［24］。Hopwood等对关节炎患者进行基因芯片分析，认为包括TGFβ的多种信号参与了关节炎的发生［25］。另一方面，Furumatsu等人研究表明Smad3可促进软骨细胞增殖，Smad3激活可增强核因子Sox9与CBP／p300的结合，促进α1Ⅱ型前胶原(COL2A1)基因的表达，后者是软骨细胞的特异性增殖基因［26］。

    4  结  语

    尽管骨修复机制错综复杂，且TGFβ对骨修复具有两方面作用，但目前的研究可以肯定，TGFβ通过抑制间充质干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化延迟骨修复的过程需要Smad3的激活。另一方面，TGFβ作为细胞因子可通过其他途径(非Smad3信号途径)促进骨修复作用，如Ca2+作为TGFβ的胞内第二信使增强成骨细胞功能［27］。由此推断，Smad3拮抗剂或许能有效促进骨修复，这将成为今后研制促进骨修复药物的一个重要方向。

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作者单位：成都军区昆明总医院 a.附属骨科医院；b.眼科，云南省 昆明