赛来昔布对人骨肉瘤类肿瘤干细胞移植瘤微血管生成的影响

【摘要】  ［目的］ 探讨cox-2抑制剂赛来昔布（Celecoxib）对骨肉瘤类肿瘤干细胞裸鼠移植瘤生长及微血管生成的影响。［方法］ 无血清培养法从骨肉瘤细胞株MG-63中分离出类肿瘤干细胞建立裸鼠移植瘤模型。30只成瘤裸鼠随机分Celecoxib组和对照组，Celecoxib：25 mg/（kg·d），用药15 d，第27 d处死裸鼠，观察肿瘤体积、抑瘤率，免疫组化技术检测VEGF表达及CD34标记的MVD值。［结果］分离的骨肉瘤类肿瘤干细胞有致瘤性，可以建立动物模型。Celecoxib抑瘤率为23.2%，Celecoxib组裸鼠移植瘤的体积、VEGF的表达、MVD值均显著低于对照组（P＜0.05）。［结论］骨肉瘤类肿瘤干细胞可以建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型。Celecoxib可以抑制肿瘤生长，减少移植瘤组织VEGF的表达，减少微血管生成，具有抗血管生成作用。

【关键词】  骨肉瘤； 肿瘤干细胞； 血管内皮生长因子； 赛来昔布； 血管生成

Antiangiogenesis effect of celecoxib on xenografted human osteosarcoma stem-like cells in nude mice∥ZHANG Pei-gen，WANG Shuan-ke，KANG Xue-wen，et al.Institute of Orthopedics，No.2 Hospital,Lanzhou University,Lanzhou 730030,China

    Abstract: ［Objective］To explore the effects of celecoxib on growth and angiogenesis of the xenografted human osteosarcoma stem-like cells in nude mice. ［Method］Human osteosarcoma stem-like cells were isolated from human osteosarcoma cell line MG-63 with serum-free culturing techniques. The xenografted models of human osteosarcoma stem-like cells were successfully established using subcutaneous injection of human osteosarcoma stem-like cell in 30 nude mice and randomly divided into the control and celecoxib groups. Oral administration was carried out in both groups , with 25 mg/kg/d of celecoxib in the celecoxib group and the same volume of deionized water in the controls. This treatment lasted for 15 days and all mice were sacrificed 27 days after to investigate the tumor volumes and tumor inhibitory rate.VEGF expression and CD34 tagged microvessel density (MVD) value was detected by immunohistochemical staining.［Result］The isolated human osteosarcoma stem-like cell exhibited tumorigenesis and the animal model was established at 15 days of administration.The tumor inhibitory rate was 23.2%, and the tumor volumes, VEGF expression and MVD values were significantly lower than those in control group (P<0.05).［Conclusion］Human osteosarcoma stem-like cells can be used to establish xenografted osteosarcoma model in nude mice.Celecoxib showed a significantly inhibitive effects on growth, VEGF expression and angiogenesis of xenografted osteosarcoma.

    Key  words：osteosarcoma；  neoplastic stem cell；  VEGF；  celecoxib；  angiogenesis

    骨肉瘤是一种富含血管的高度恶性肿瘤。肿瘤血管形成与骨肉瘤的生长，浸润与转移密切相关。骨肉瘤干细胞是骨肉瘤发生发展的源泉，也与肿瘤的复发转移密切相关，且现有的治疗方法不能将肿瘤干细胞杀灭，并且具有耐药机制使肿瘤难以治愈［1］。抗血管生成治疗已成为继手术、放疗、化疗之后一种新的肿瘤治疗方法。VEGF是骨肉瘤血管生成的最关键刺激因子。骨肉瘤细胞可以自身合成、分泌VEGF［2、3］ 。cox-2可诱导VEGF表达，促进肿瘤血管形成，促进肿瘤生长［4～6］。选择性的抑制肿瘤组织内新生血管的生成，使肿瘤组织供血不足生长受阻的抗血管治疗是肿瘤治疗的最新模式［7］。

    本研究通过在MG-63细胞系中分离骨肉瘤类肿瘤干细胞(sarcosphere)，并且建立人骨肉瘤类肿瘤干细胞裸鼠移植瘤模型，探讨cox-2抑制剂对骨肉瘤类肿瘤干细胞移植瘤模型微血管生成的影响，为进一步研究骨肉瘤干细胞和抗肿瘤新生血管提供理论和实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  主要材料与试剂

    人骨肉瘤细胞株MG-63(来源于ATCC，购自中国科学院细胞库)，DMEM／F12(1∶1)培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(上海尚宝生物科技公司)，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺(华美公司)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)(Sigma公司)，胰岛素、青霉素、链霉素(华北制药厂)，鼠抗人VEGF,CD34单克隆抗体，免疫组织化学显色试剂盒(北京中杉金桥公司)，Celecoxib（辉瑞公司），裸小鼠30只(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，成像系统OLYMPUS-DP71。

    1.2  方法

    1.2.1  MG-63细胞的培养  人骨肉瘤细胞系MG-63，常规培养于含10%特级胎牛血清，青霉素100 u／mL和链霉素100 u／mL的EMDM／F12培养基中，置于5%CO2，37°C的饱和湿度培养箱中培养。

    1.2.2  类骨肉瘤干细胞分离培养及传代  取原代培养的MG-63骨肉瘤细胞用0.25% 胰蛋白酶消化5～10 min，10%含血清培养液终止消化，充分吹打成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min弃上清液后，用无血清培养基(DMEM／F12培养基，含EGF 20 μg／L、bFGF 20 μg/L、L-谷氨酰胺2 mmol／L、胰岛素4 u／L、青霉素100 u／mL和链霉素100 u／mL调pH至7.2～7.4)重悬细胞，调整至2×108／mL个活细胞终浓度接种在六孔培养板中，在37°C、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，隔日加EGF、bFGF 1 ml。培养5～7 d，待培养基中悬浮的肉瘤细胞球（sarcosphere）体积较大后，吸取培养基并离心，用无血清培养基重新吹打成单细胞悬液，按1∶2或1∶3比例传代。

    1.2.3  MTT法检测类肿瘤干细胞增殖活性  将无血清培养的骨肉瘤类肿瘤干细胞按1×103个/孔接种与96孔培养板，设加培养基不加细胞的孔作为对照组作为调零。置于5%CO2，37°C饱和湿度条件下培养。分别在0、1、2、3、4、5、6、7 d，测量孔加MTT 20 μl，继续培养4 h，终止培养，加DMSO 150 μL振荡10 min，全自动荧光酶标仪在490 nm下测吸光度值(A)，取均值绘制生长曲线。

    1.2.4  建立骨肉瘤类肿瘤干细胞移植瘤模型  将悬浮的骨肉瘤细胞球离心，PBS重悬，调整浓度为105，备用。在超净层流工作台中，取裸鼠，碘伏和酒精消毒注射部位，微量注射器取0.1 ml悬液接种裸鼠背部皮下，第3 d原位重复注射1次，观察肿瘤生长情况。10 d后30只裸鼠全部成瘤。移植瘤生长良好，动物模型成功建立。

    1.2.5  Celecoxib对裸鼠移植瘤模型的处理  在裸鼠移植瘤长至0.4～0.6 cm时，随机分为2组（Celecoxib组和对照组），Celecoxib组给celecoxib 25 mg/（kg·d）口服，共15 d，对照组给去离子水，用药前及用药后3 d用游标卡尺测量肿瘤的最长径、最短径，共6次，计算肿瘤体积，并绘制生长曲线。VT=ab2/2(a为肿瘤的最长径，b为肿瘤最短径)。抑瘤率=［(对照组肿瘤的平均体积-实验组肿瘤的平均体积)／对照组肿瘤的平均体积］×100% 。停药后72 h颈椎脱臼处死裸鼠，剥离肿瘤、称重。将肿瘤组织与10%的甲醛固定，石蜡包埋，连续切片（4～5 μm）备用。

    1.2.6  移植瘤组织进行VEGF、CD34免疫组织化学染色  将石蜡包埋连续切片采用Envision二步法检测, DAB显色，按试剂盒说明逐步操作，各组标本同一批同一条件下染色，以PBS作为阴性对照，用阳性切片作为阳性对照。结果判断：普通光镜下观察，VEGF阳性表达呈棕褐色，以胞浆着色为主。每张切片在高倍镜下(×200)随机选择5个视野，计数200个细胞／视野，共计1 000个。阳性细胞数<10%为阴性(-)，阳性细胞数>11%为阳性(+)。以CD34标记MVD,参照Weidner［8］等提出的方法对结果进行MVD量化分析。在肿瘤微血管内皮细胞膜上呈现棕黄色为阳性标准。先在40倍光镜下扫视整个切片寻找血管高密度集中的区域作为“热点”，确定每例切片中3个肿瘤微血管密度最高区域,然后在400倍镜下计数3个高倍视野内微血管数,取其平均值作为MVD值。所有切片由2名副高以上病理医生单独阅片。

    1.2.7  统计学处理  采用SPSS 11.5统计分析软件， MVD值用独立样本t检验，VEGF表达用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  类肿瘤干细胞的增殖活性  类肿瘤干细胞的增殖潜伏期约为24 h，传代后24～48 h即可见传代的肿瘤干细胞形成，以后细胞数量逐渐增多。类肿瘤干细胞的对数倍增时间约为传代后第3～5 d。A值在第7 d最高，与0 d的A值比较差异有统计学意义（P＜0.01，图1a）。

    2.2  赛来昔布对骨肉瘤类肿瘤干细胞移植瘤生长的影响  肿瘤细胞球接种10 d后30只裸鼠成瘤，成瘤率100%。移植瘤生长曲线表明，给药后15 d Celecoxib组肿瘤体积为（0.86±0.178）cm3，对照组为（1.12±0.154）cm3，抑瘤率达 23.2%，两组比较差异有统计学意义（t=4.142，P=0.000＜0.05，图1b）。

    2.3  骨肉瘤类肿瘤干细胞的形成  无血清法培养7～10 d左右可以形成数个细胞聚集的骨肉瘤细胞球（sarcosphere），悬浮生长，大部分细胞不能形成细胞球，坏死裂解。（图2a）以后体积逐渐增大，形态规整，可见分裂的次代细胞生长（图2b）。

    2.4  移植瘤组织HE染色和免疫组织化学染色  移植瘤位于裸鼠背部皮下，与皮肤无粘连，周围有假胞膜形成，边界清楚，切面灰白色。HE染色可见移植瘤组织癌细胞呈梭行或多边形，胞核大小不一、深染。

    2.4.1  移植瘤组织中VEGF免疫组织化学检测  对照组中移植瘤细胞VEGF染色阳性率为80%，Celecoxib组中染色明显减淡，阳性率40%。两组比较有统计学意义(x2=5.00，P=0.025＜0.05，表1,图2c、d)。

    2.4.2  移植瘤组织中CD34免疫组织化学检测  在移植瘤组织中，CD34在微小血管内皮均棕黄色表达,Celecoxib组MVD值（21±5.529）对照组MVD值（29±5. 014）两组比较有统计学意义（t=4.151，P=0.00＜0.05,图2e、f）。表1  各组移植瘤组织中VEGF的表达分组VEGF表达阳性阴性Celecoxib组69对照组123  图1类肿瘤干细胞

　　3  讨论

    骨肉瘤是起源于间充质细胞的原发性恶性肿瘤，血运丰富，发展迅速,病死率和转移率极高,可早期通过血行转移，尤其是肺转移，给治疗带来极大困难。2005年，Gibbs［9］等首先用无血清培养法分离出了骨肉瘤类肿瘤干细胞（“Sarcosphere”），并且鉴定“Sarcosphere”具有间充质干细胞特性，能诱导成骨组织和脂肪组织，而且有很强的自我更新和增殖分化的能力。2007年，Wilson［10］等在MG-63细胞系中用相同的方法分离出“Sarcosphere”。本研究参照Gibbs［9］和欧阳振［11］无血清培养法，分离培养出了“Sarcosphere”，该细胞有很强的致瘤性，比常规细胞接种数量低，104数量级就可以致瘤，成瘤率高,可以作为骨肉瘤干细胞研究的动物模型。

    70年代初，Folkman提出肿瘤的血管依赖学说,肿瘤生长，浸润，转移播散依赖新生血管的生成被广泛认识和接受,没有血管生成,肿瘤直径达1～2 mm即不能生长。骨肉瘤的生长和转移同样取决于新生血管的生成和发展［12、13］。

    本研究运用高表达VEGF的MG-63细胞分离骨肉瘤类肿瘤干细胞建立皮下移植瘤模型，给予Celecoxib处理后，使骨肉瘤移植瘤生长缓慢，抑瘤率达到23.2%，Celecoxib组中VEGF表达较对照组明显降低。 MVD是用CD34标记肿瘤微血管,对肿瘤新生微血管生成进行直接观察并量化的方法。本研究测得celecoxib组MVD值（21±5.529）对照组MVD值（29±5.014），显示Celecoxib明显减少了肿瘤微血管的生成。这可能是通过抑制cox-2催化产生的PGE2 ，减少EP受体-cAMP信号传导系统激活细胞内蛋白激酶来调节肿瘤中VEGF的转录和表达，减少了肿瘤血管生成。VEGF是目前发现的最重要的促血管生成因子，在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用，通过促进血管形成，提高血管通透性，促使肿瘤生长和转移。Hicklin等［14］研究发现,激活VEGF受体途径能促发血管形成,促进内皮细胞的增生、迁徙和从血管中获得营养而存活。Schoeffner等［15］研究表明,VEGF主要通过自分泌和旁分泌的方式提高肿瘤血管化,促进肿瘤细胞的增殖和抑制肿瘤细胞的凋亡,从而促进肿瘤的生长。梅炯等［16］的研究表明，VEGF基因与骨肉瘤细胞的增殖、凋亡关系密切,对骨肉瘤血管生成有重要作用。用VEGF特异的siRNA作用于骨肉瘤细胞MG-63，引起VEGF表达下降，细胞生长抑制，能诱导MG-63细胞早期凋亡，在血管模型中减少了VEGF相关的微血管表达。

    cox是一种膜结合蛋白，是分解花生四烯酸转化成前列腺素的关键酶。诱导型cox-2启动肿瘤细胞生长、血管生成、并促进浸润和转移。cox-2诱导花生四烯酸合成的PGE2同样在肿瘤的血管生成中起作用,诱导血管生长因子如VEGF、bFGF合成。Jensen等［17］研究发现，cox-2催化产生的PGE2 通过EP受体-cAMP信号传导系统激活细胞内蛋白激酶来调节肿瘤中VEGF、bFGF基因的转录和表达，促进肿瘤血管生成，而cox-2抑制剂可显著抑制这一过程。cox-2的表达水平与肿瘤组织中的微血管密度及VEGF mRNA含量呈正相关,运用cox-2选择性抑制剂可显著抑制肿瘤组织的血管生成,这表明cox-2与肿瘤血管新生密切相关。

    Celecoxib通过抑制cox-2减少VEGF的产生而达到抗肿瘤血管生成是肿瘤治疗的一个新方法。对于高度血管化的骨肉瘤，减少或者封闭VEGF对抗骨肉瘤微血管生成有显著的效果。本研究表明cox-2有可能成为抗骨肉瘤微血管生成的一个辅助治疗，为骨肉瘤治疗提供一条新的干预途径。

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作者单位：兰州大学二院骨科研究所，甘肃兰州