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【摘要】 [目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响。[方法] 采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架，分别于4℃、20℃、36℃条件下，在0.5%京尼平水溶液中交联24 h。以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照，评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点。[结果]随交联温度升高，支架的交联度明显增大，溶胀率和降解率逐渐减小。4℃组支架交联度47.88%±6.4%，溶胀率为721%±46%，4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%，溶胀率为662%±72%，4周降解0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%，溶胀率为635%±27%，4周降解0.66%±7.3%，三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01)。[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率，且对支架结构和生物相容性无明显影响。交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能力，较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架。
【关键词】 交联温度; 壳聚糖; 胶原; 京尼平; 组织工程
Effect of temperature on crosslinking of collagen/chitosan scaffolds with genipin∥CAO Zheng,HU Yun-yu,PAN Wei-min,et al.Institute of Orthopaedic Surgery of PLA at Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi’an 710032, China
Abstract: To investigate the changes of pore sizes,crosslinking index,swelling ration,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility of genipin crosslinked collagen/chitosan scaffolds affected by the different crosslinking temperature points.The freeze-dried collgaen/chitosan scaffolds crosslinked with 0.5% genipin within 24 h were divided into 3 groups by crosslinking temperature:4℃ group,20℃ group and 36℃ group.The characteristics of pore sizes,crosslinking index,swelling ratio,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility were evaluated.Collagen/chitosan scaffolds without crosslinking were chosen as control group.With the increase of temperature,crosslinking index was increased,but swelling ratio and degradation rate were decreased.In 4℃ group,the crosslinking index was 47.88%±6.4%,the swelling ratio was 721%±46%,and the degradation rate was decreased by 3.95%±6.4% at 4 weeks.In 20℃ group,the crosslinking index was 67.69%±3.6%,the swelling ration was 662%±72%,and the degradation rate was 0.91%±5.9% in 4 weeks.In 36℃ group,the crosslinking index was 70.32%±5.7%,the swelling ration was 635%±27%,and the degradation rate was 0.66%±7.3% at 4 weeks.The above indexes of the three groups were much better than those of control group(P<0.01).It was indicated that the swelling ratio and degradation rate of the collagen/chitosan scaffolds are significantly decreased by genipin without any obvious change of pore sizes and toxicity.The biocompatibility and degradation rate of this tissur engineering scaffold can be well obtained with genipin by increasing crosslinking temperature within 24 h.
Key words：crosslink temperature; chitosan; collagen; genipin; tissue engineering
胶原因其良好的组织相容性和可降解性被广泛用于组织工程研发领域。但由于其机械强度不足，在体内水解过程中不能保持空间构型，且吸收过快，因此，在应用时常加入壳聚糖等成分，以提高支架的弹性模量、临界形变和强度[1]。交联可进一步提高支架的机械强度和抗蛋白酶降解的能力。但物理交联法交联度较低且不均一，而化学交联法采用戊二醛、甲醛等传统的交联剂，易引起中毒或不良反应。
京尼平是一种提取自栀子果实的天然交联剂，其毒性远远低于传统的化学交联剂。细胞实验表明其毒性低于戊二醛104倍，而细胞增殖能力高于戊二醛组5×103倍[2]。但是既往对于京尼平的研究多集中于单一材料，且多关注交联时间及交联剂浓度对于材料交联的影响，而观察交联温度对京尼平交联复合支架影响的研究未见报道。本实验拟通过观察支架孔径、交联度、降解率、溶胀率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖复合支架的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
壳聚糖(WOLSEN)，鼠尾胶原，京尼平(和光纯药工业株式会社)，甘氨酸(solarbio)，冰醋酸、异丙醇、乙二醇甲醚、茚三酮均购自国药集团化学试剂有限公司。DMEM培养基(gibco)，胎牛血清(hyclone)，胰蛋白酶(sigma)，冷冻干燥机(CHRIST)，倒置相差显微镜(nikon)，分光光度计(HITACHl)，扫描电镜(HITACHl)。
1.2 多孔支架的制备及交联
配制0.2 mol/L的醋酸溶液，分别称取一定质量的壳聚糖和胶原粉末，将其完全溶解于稀醋酸溶液中，静置脱除溶液中的气泡。将两种溶液按一定比例混合，充分搅拌混合均匀。将胶原、壳聚糖混合液注入模具中，置于冷冻柜中-20℃冷冻成型，样品完全冻结后冷冻干燥12 h，制得胶原/壳聚糖复合支架。将上述支架于风箱中挥发残留醋酸后，置于0.5%的京尼平水溶液中，分别于4℃、20℃、36℃交联24 h后，蒸馏水冲洗后置于饱和甘氨酸溶液中浸泡，换液至溶液不再变色后用蒸馏水反复冲洗，重新冷冻干燥。
1.3 扫描电镜观察
将样品裁剪成直径4 mm高2 mm大小的小片，真空喷金后，扫描电镜观察表面结构和孔径变化，选择合适的放大倍数拍摄扫描照片。
1.4 交联度测定
参照Mi的方法采用茚三酮法测定交联度[3]。具体为：①1.05 g的柠檬酸和10 ml(1.0 mol/L)的NaOH和0.04 g的氯化亚锡(SnCl2·2H2O)混合，加去离子水调至25 ml，另将1 g的茚三酮加入25 ml乙二醇甲醚中，再将上述两液体混合搅拌45 min，制成茚三酮溶液，避光保存。②称取样品，加入4 ml茚三酮溶液，100℃水浴20 min，冷却至室温，加20 ml 50%异丙醇溶液，用分光光度计在570 nm下测量吸光度。用甘氨酸溶液做标准曲线，并通过此标准曲线查找各样本中自由氨基酸的摩尔数。所有反应均在暗室进行。以Mo表示未加京尼平的相应支架中含自由氨基酸摩尔数，Mt表示各组交联样品中氨基酸摩尔数，按以下公式计算各组材料的交联度：交联度=(Mo-Mt)/Mo×100%。
1.5 降解率测定
各组受试材料分别称重(Wo)，将材料放回离心管中封装好，环氧乙烷消毒，然后加25 ml PBS溶液，3 d换液1次，1，2，4周取出，蒸馏水反复冲洗后再次冻干后称重(Wt)。降解率=(Wo-Wt)/Wo×100%。
1.6 溶胀率测定
称取支架在干态时的质量为Wo，然后将支架在PBS中浸泡24 h后小心取出，用滤纸吸干表面的水分，称重为Wt，则支架溶胀率=(Wt-Wo)/Wo×100%。
1.7 细胞毒性实验
将京尼平交联的胶原/壳聚糖切成直径4 mm高2 mm大小，Co60照射消毒。参照胡声锁等的方法制备兔成体脂肪干细胞[4]，消化状态较好处于对数生长期的兔脂肪干细胞调整浓度至1×106/ml，负压接种于支架上，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育4 h后将细胞支架复合体置入96孔板，每孔加入培养液200 μl，设为实验组。将细胞以密度为1×104/ml直接接种于96孔板，每孔200 μl，设为对照组。另将单纯材料加入96孔板，每孔加入培养液200 μl，设为实验调零组，空白孔加入培养液200 μl，设为对照调零组。在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育，培养液继续培养，隔天换液。培养1、3、5、7、14 d MTT法检测细胞活力，实验组、对照组分别以对应的调零组调零，以计算其相对增殖率，评价细胞毒性。
1.8 组织相容性实验
新西兰兔6只(体重1.5～2 kg)，速眠新Ⅱ肌注麻醉后，无菌条件下切开双侧股部皮肤，分离肌肉组织，每侧分别植入支架材料，不可吸收缝线缝合，观察动物术后一般情况和伤口情况，于手术后2周、4周后处死动物，取材料连同周围组织，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色光镜观察。
1.9 统计学处理
用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，样本均数间比较使用方差分析。P<0.01具有统计学意义。
2 结果
2.1 多孔支架的结构和孔径
经冻干制得的胶原/壳聚糖支架为乳白色，有弹性，较柔软，交联后的支架为深蓝色，随着交联温度的提高，其颜色逐渐加深。图1示，冻干的胶原/壳聚糖支架孔隙丰富，大小比较均一，且孔与孔之间相互联通构成了交通孔。支架交联后的孔隙结构无明显变化。
2.2 交联度
表1示，随交联温度升高，三组交联组支架交联度升高。20℃组达到了67.69%、36℃组达到了70.32%，与4℃组比较有显著差异(P<0.01)。而20℃组和36℃组的差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 降解率
2周时只有4℃组有少量降解，4周时交联组均有少量降解，与未交联组比较均有显著差异(P<0.01)，且0℃组和36℃组降解率较4℃组明显降低(P<0.01)。而20℃组和36℃组之间无明显差异(P>0.05)。
2.4 溶胀率
交联后支架溶胀率较未交联组明显降低(P<0.01)，且随着交联温度的升高，溶胀率均有所降低，但各交联组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 细胞毒性
依照表2评判标准，各组材料均表现出较低的细胞毒性，提示交联后材料均为合格的组织工程支架材料。图1各组支架材料扫描电镜图 a 为未交联支架组 b 为4℃组 c 为20℃组 d 为36℃组表1 各组的孔径、交联度、降解率、溶胀度、细胞毒性实验结果未交联支架4℃，0.5%G，24 h20℃，0.5%G，24 h36℃，0.5%G，24 h孔径(μm)199.22±66.32207.30±49.86194.41±48.85203.32±47.22交联度(%)47.88±6.467.69±3.670.32±5.7降 解 1周13.72±5.9率(%) 2周19.45±7.11.67±6.8 4周23.22±6.33.95±6.40.91±5.90.66±7.3溶胀率(%)892±63721±46662±72635±27细胞增殖率(%)98.494.2103.697.4细胞毒级11012.6 组织相容性实验
所有实验动物手术后饮食活动正常，伤口一期愈合，植入区局部皮肤无红肿、破溃及材料外露。组织学观察，可见支架材料周围无组织变性及坏死现象，未见明显的炎性细胞浸润，2周及4周组均维持多孔样结构，无明显材料降解。
表2 与细胞增殖度相对的细胞毒级别细胞毒级别细胞相对增殖度(%)材料评价0≥100合格175～99合格250～74结合细胞形态综合评价325～49不合格41～24不合格50不合格
3 讨论
文献报道，胶原/壳聚糖复合冻干支架具有三维立体多孔结构，可模拟天然软骨细胞外基质的化学构成，理论上应该是一种较为理想的组织工程软骨支架。但由于上述支架有一定的压缩性，在体内水解过程中不能保持空间构型并且吸收过快，因此为了达到组织工程应用所要求的参数，如变性温度、机械强度和抗蛋白酶降解的能力等，在使用前需进行交联。本实验用天然交联剂京尼平对胶原/壳聚糖支架进行交联，希望在提高生物材料抗降解能力的同时，保留其良好生物相容性。但胶原等生物材料在较高温度下容易变性，从而丧失部分生物活性，因此本实验选择在可以保持材料生物活性的较低温度段，取等距离的3个温度点：4℃、20℃、36℃，进行研究。
现多认为大小合适，孔径均匀且有合适的交通孔是构建组织工程支架的重要要求[5]，而对于软骨组织工程支架，广泛存在的较大的交通孔有利于软骨细胞和基质的产生[6]。本实验构建的支架材料孔径约为200 μm，可见广泛存在的较大交通孔，利于细胞的生长及营养和代谢产物的输送。本研究结果显示交联组支架孔径形态大小较未交联支架无明显变化，分析可能是因为京尼平交联是在支架结构形成的基础上进行的。而冻干支架孔径的大小主要取决于冷冻过程中形成冰晶的大小，和冷冻温度以及降温速度密切相关[7]。因此在本研究中，各组支架孔径的大小主要取决于冷冻温度以及降温速度，而交联组支架经过二次冻干，孔径结构更为均一[8]。
本研究发现，交联温度的升高可以促进混合支架交联度的提高，20℃、36℃组较4℃组均有明显提高，达到较高交联度，而20℃组和36℃组交联度无明显差异。结果表明，交联温度的升高可以增加分子运动速率从而显著提高交联速率，而随着交联的进行，自由氨基逐渐减少，使得在交联度达到较大值后，交联过程减慢，因此交联温度的进一步升高，并未显著提高交联度。
胶原和高脱乙酰度的壳聚糖均有良好的生物降解性，两者共混制得的材料也因两者的比例不同表现出相应的降解率。京尼平交联大大减缓了支架材料的降解，各组交联材料均表现出了较未交联组高的抗降解能力。20℃、36℃组的抗降解能力较4℃组的明显提高，而20℃组和36℃组的差异无统计学意义，表现了和交联度变化相似的趋势。Bigi[9]报道了交联可以显著降低支架材料的溶胀率，在本实验中也可看出同样的趋势。而溶胀率的大小不仅和材料的性质相关，而且同样受支架结构的影响。在本实验中，各组支架结构无明显区别，这可能是各交联组之间溶胀率无显著差异的原因。
细胞毒性试验是反映材料生物相容性的一个重要指标，本实验中，交联后材料对细胞增殖无明显影响，细胞毒性级别为0、1级，表明交联后材料具有良好的细胞相容性。
体内埋置实验发现本支架材料能够很好的被宿主接受，无材料排异、过敏反应等不良结果发生;组织切片结果表明，该支架材料无明显炎症反应及异物反应，能与植入部位组织很好的相容，表明具有良好的组织相容性。这也可能是京尼平毒性较低及交联后生物材料抗原表位暴露减少的原因。此外，该支架材料在体内的降解吸收不显著，且能维持三维空间结构，提示交联大大缓解了胶原/壳聚糖支架的降解，更好地稳定了支架的结构。但是细胞接种后表型维持以及修复软骨损伤的效果还有待进一步研究。
可降解性和生物相容性是组织工程材料的两个重要要求，通过本实验可见，京尼平交联胶原/壳聚糖支架不仅改善了胶原等生物材料降解过快的缺点，而且保留了支架良好的生物相容性。提高交联温度可以在较短时间内显著提高支架的交联度和抗降解能力，获得有良好生物相容性和降解率的组织工程支架。在20℃即接近室温的条件下在0.5%的京尼平水溶液中交联24 h，即可获得有良好交联度、抗降解能力和生物相容性的组织工程支架，便捷的制备工艺也使其拥有更广阔的使用前景。
【参考文献】
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作者单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安 710032