骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合效果及示踪的实验研究

【摘要】  　　目的 观察骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合的影响，并为干细胞的标记示踪提供实验依据。[方法]采用贴壁分离筛选法获取大鼠的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)，用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)和DiI(1,1’dioctadecyl-3,3,3’,3’tetramethylindocarbocyanine perchlorate)对其标记。39只8周龄雄性SD大鼠随机分为两组，实验组21只，对照组18只。实验组在骨隧道内腱-骨结合面注入含双标的BMSCs和Pluronic F127载体，对照组只注入载体，术后2、4、8周进行生物力学评估愈合效果，实验组2、4、8周组织冰冻切片荧光显微镜和手术后即刻、3、7 d行7.0 T MR示踪移植的BMSCs。[结果]SPIO、DiI能有效标记干细胞。实验组2、4、8周荧光显微镜观察在腱骨界面有DiI标记的阳性细胞存在。7.0 T MR未能在实验组腱骨界面观察到明显信号改变。生物力学最大拔出载荷实验组和对照组在术后2周无统计学差异，在4、8周实验组显著高于对照组(P<0.05)。[结论]移植的骨髓间充质干细胞可以促进骨隧道内腱骨结合部的早期愈合，DiI能有效标记示踪干细胞，SPIO能有效标记干细胞，但在该实验模型中7.0T MR可能不能活体示踪磁粒子标记的干细胞。

【关键词】  骨髓间充质干细胞 骨隧道 腱-骨结合部 超顺磁氧化铁 DiI 示踪

　　Experimental study of tendonbone healing using bone mesenchymal stem cells in a bone tunnel and their labeling and tracing∥DONG Peilong,WU Xiaotao,LI Yonggang,et al. Department of Orthopaedics，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009，China

　　Abstract：To evaluate the effect of bone mesenchymal stem cells(BMSCs) on healing of tendonbone junction in a bone tunnel and to provide experimental evidence of labeling and tracing the stem cell. BMSCs from rats were harvested by adherent separation screening method and labeled by SPIO and DiI. Thirtynine 8weekold rats were randomly divided into two groups,21 rats injected with doublelabeled BMSCs and Pluronic F127 as experimental group and 18 rats injected with Pluronic F127 alone as control group.In each group, biomechanical analysis was carried out to assess the effect of healing at 2,4 and 8 weeks.The transplanted BMSCs were traced by fluorescence microscope at 2, 4, 8 weeks and 7.0T MR instantly,3 and 7days after operation.BMSCs were labeled effectively by SPIO and DiI.DiIlabeled positive cells were observed between tendon and bone with fluorescence microscope at 2,4 and 8 weeks. No significant signal changes of tendonbone interface could be observed by 7.0 T MR.Biomechanically, maximum pullout load had no statistical difference between experimental group and control group at 2 weeks.At 4 and 8 weeks, the experimental group had significantly higher maximum pullout load compared with control group (P<0.05).The transplanted BMSCs could accelerate the early healing of tendonbone interface in a bone tunnel. BMSCs were labeled and traced effectively by DiI. BMSCs can be effectively labeled with SPIO, but 7.0T MR could not magnetically labeled BMSCs in vivo in the experimental model.

　　Key words：bone mesenchymal stem cells; bone tunnel; tendonbone interface; superparamagnetic iron oxide; DiI; tracing

　　交叉韧带重建后早期最薄弱的部位是骨隧道内腱骨结合部，促进其早期愈合一直是学者们研究的热点之一。Pittenger等[1]研究表明，BMSCs在一定的诱导条件下可以分化成脂肪细胞、神经细胞、造血细胞、肌腱细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞，正是其多向分化的特性，使治愈不可逆病变的疾病成为可能。Ouyang、Lim等[2，3]发现BMSCs能提高骨隧道内腱骨结合部的愈合。但由于缺少对BMSCs的标记和示踪，移植到体内的BMSCs的存活及分布情况仍不清楚。本实验将双标的BMSCs移植入大鼠关节外骨隧道内腱-骨模型中，用组织冰冻切片荧光显微镜和7.0T磁光振仪(MR)对其示踪，并用生物力学试验评价早期愈合效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物 6周龄雄性SD(sprague dawley,SD)大鼠(清洁级，购自东南大学医学院实验动物中心)，为细胞移植供体;8周龄雄性SD大鼠(清洁级，购自东南大学医学院实验动物中心)，为细胞移植受体。

　　1.1.2 主要试剂DMEM ( Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)培养液(Gibco公司，美国);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);胰酶( Amresco公司，美国);普鲁士蓝试剂盒(上海虹桥乐翔医用试剂公司);DiI(Molecul Prober，美国);Pluronic F-127(Sigma公司，美国)。

　　1.1.3 主要设备 CO2培养箱(Herabus公司，德国);倒置相差显微镜(Zeiss公司，德国);净化工作台(吴江市生化净化设备厂);细胞培养瓶(Corning公司，美国);7.0T磁共振仪(Bruker公司，德国);CSS-44020型生物力学试验仪(长春仪器厂)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 大鼠BMSCs的体外分离、培养和传代 无菌条件下取6周龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨，用培养液(含10%胎牛血清、青霉素100 U/ L、链霉素100 μg / L的低糖DMEM)冲洗出骨髓，收集骨髓细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，再用培养液洗涤1次，重悬于培养液中，调节细胞浓度至1×106/ml，接种于25 cm2 培养瓶内，5% CO2、37℃孵箱中培养，3 d首次换液，以后每3 d换液1次，待贴壁细胞至80%～90%融合时，胰蛋白酶消化1∶2传代后继续培养，培养过程中倒置相差显微镜动态观察细胞。

　　1.2.2 SPIO和DiI标记细胞 合成10 g/L SPIO，核心粒径(10±5) nm，饱和磁化强度为60A·m2 /kg，将SPIO加入P3代BMSCs培养液中进行标记，根据文献及前期实验，铁终浓度为25 μg/ml，在37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h，后加入终浓度为0.1 mol/L的DiI，37℃、5%CO2培养箱内孵育5 min，后4℃冰箱孵育15 min，然后37℃、5%CO2培养箱内孵育2 h除去培养液后磷酸缓冲液反复冲洗，少量细胞进行细胞爬片普鲁士蓝染色证实细胞内铁，荧光显微镜检测DiI的标记率，其余胰酶消化解除贴壁后收集细胞，用于细胞移植。

　　1.2.3 动物实验 取39只雄性SD大鼠，体重300～350 g，实验组21只，对照组18只。用1%的戊巴比妥钠50 mg/Kg腹腔注射行全麻。将大鼠仰卧位固定于手术台上，无菌条件下取右下肢内侧纵行切口，钝性分离皮下组织，分离出趾长屈肌腱，远端离断，后在胫骨近端钻一直径约1.5 mm的骨隧道，再把肌腱从内向外引出，末端用5-0丝线缝在骨膜上，实验组在腱骨界面注入含双标BMSCs和Pluronic F-127，对照组只注入载体，然后逐层关闭切口，术后大鼠在笼内自由活动。

　　1.2.4 7.0T MR观察 实验组在术后即刻、3、7 d完全随机法取2只大鼠做MRI，麻醉下将大鼠固定于7.0T MR仪检查床上，大鼠体部线圈，视野( FOV)5.53 cm×6.12 cm;矩阵为256×256;成像序列：(1)SE序列：T1WI，TR 1 300 ms，TE 7.5 ms;(2)快速自旋回波(FSE)序列：T2WI，TR 4 200 ms， TE 36 ms，观察在T2加权像腱骨结合部的信号改变。

　　1.2.5 组织冰冻切片荧光显微镜观察 实验组分别于术后2、4、8周每组各处死1只老鼠，取胫骨近端为标本行冰冻切片，甘油封片，荧光显微镜观察DiI标记细胞在骨隧道内的分布情况。

　　1.2.6 生物力学试验 术后2、4、8周取得标本，去除趾长屈肌腱和胫骨外的所有组织，保留尽量长的趾长屈肌腱，将标本固定在CSS44020型生物力学仪上，以5 mm/min的速率进行牵拉试验至肌腱从骨隧道中完全脱出，此时的牵拉力为腱骨结合面所能承受的最大拔出载荷。实验数据采用SPSS13.0统计学软件进行处理，最大拔出载荷采用均数±标准差表示，同一时间点实验组和对照组采用t检验，组内不同时间点采用方差分析，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 倒置相差显微镜下活细胞形态学观察

　　骨髓细胞接种后，呈球形，悬浮于培养液中，6～8 h开始逐渐贴壁，初期的贴壁细胞多为不规则形或短梭形，之后生长增快，形态也渐变为长梭形，约9 d贴壁细胞长满约95%(图1a)，即可传代，传代后细胞生长速度加快，2～4 d传代1次，到第3代细胞呈长梭形生长(图1b)。

　　2.2 SPIO、DiI标记后显微镜观察

　　SPIO、DiI标记的细胞在倒置相差显微镜下观察，几乎每个细胞浆内都有棕黄色颗粒(即SPIO)，标记率近100%(图2a);经荧光显微镜观察，几乎每个标记细胞均可见到红色环状荧光，红色颗粒为细胞膜及细胞浆，中间未染色的为不着色的细胞核，标记率近100%(图2b)。

　　2.3 SPIO标记后普鲁士蓝染色

　　细胞爬片普鲁士蓝染色后，几乎每个标记细胞的细胞浆内均可看到蓝色颗粒，标记率近100%，而未标记细胞内无蓝色颗粒(图3)。

　　2.4 7.0T MR观察

　　实验组术后即刻、3、7 d在不同位置T2加权像下观察腱骨结合部，韧带呈低信号，骨组织呈高信号，未能明显发现因BMSCs内吞SPIO而引起的信号改变(图4a～4c)。

　　2.5 组织冰冻切片荧光显微镜观察

　　各时间点在骨隧道腱骨界面有一红色荧光区域，DiI标记的阳性细胞呈梭形，第8周荧光强度有衰减趋势(图5a～5c)。图1 培养的BMSCs 倒置相差显微镜×100 图1a. 初期多为不规则形或短梭形，约9d贴壁细胞长满约95% 图1b. 第3代细胞呈长梭形生长 图2 标记SPIO、DiI后的BMSCs 图2a. 几乎每个细胞浆内都有棕黄色颗粒(即SPIO)，标记率近100% 倒置相差显微镜×100 图2b. 可见红色颗粒为细胞膜及细胞浆，中间未染色的为不着色的细胞核，标记率近100% 荧光显微镜×100 图3 细胞爬片普鲁士蓝染色，倒置相差显微镜×100，几乎每个标记细胞的细胞浆内均可看到蓝色颗粒，标记率近100% 图4 实验组手术后即刻7.0T MR观察 T2加权像下韧带呈低信号，骨组织呈高信号，未能明显发现因BMSCs内吞SPIO而引起的信号改变(箭头所示) 图4a. 横断面 图4b. 矢状面 图4c. 冠状面 图5 实验组术后组织冰冻切片观察 荧光显微镜×100 各时间点在骨隧道腱骨界面有一红色荧光区域，为DiI标记的阳性细胞，第8周荧光强度有衰减趋势 图5a. 术后2周 图5b. 术后4周 图5c. 术后8周。

　　2.6 生物力学试验

　　最大拔出载荷实验组和对照组在术后2周无统计学差异，在4、8周实验组显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，实验组和对照组组内不同时间点相比，差异也有统计学意义(表1)。表1 最大拔出载荷(±s)分组术后时间2周(N)4周(N)8周(N)实验组注：*P<0.05，同一时间点实验组与对照组比较 #P<0.05，不同时间点之间各组内比较。

　　3 讨 论

　　目前交通创伤、运动损伤导致膝关节交叉韧带的损伤越来越多。临床上常采用关节镜下韧带重建手术来恢复膝关节的稳定性，其中骨隧道内腱骨结合部及早、可靠的愈合是手术成功的关键。为了患者术后尽早地进行功能锻炼，促进并加快腱骨结合部的愈合至关重要。

　　近年来学者对如何促进腱骨结合部的愈合进行了一些研究。徐钢、Walsh等[4，5]发现低强度超声可以促进腱骨结合部的修复。Sasaki等[6]发现局部应用粒细胞集落刺激因子能提高腱骨结合部的愈合。Chen等[7]证实骨膜包裹肌腱能够加快腱骨愈合过程和提高愈合强度。BMSCs是一类具有很强的自我复制和多向分化潜能的干细胞，引起了许多学者的兴趣。Ouyang、Lim等[2，3]发现BMSCs能提高骨隧道内腱骨结合部的愈合，但是他们在实验中没有对移植的BMSCs进行标记，不能在体内辨别移植的细胞，也不能观察其在腱骨结合部的生存及分布情况。本研究通过生物力学评价BMSCs对骨隧道内腱骨结合部的早期愈合效果，并对BMSCs进行有效标记、示踪其移植后在体内的生存及分布情况。

　　前交叉韧带重建术后骨隧道内腱骨结合部力学性能薄弱的时间点是在术后第6～12周[8]。本实验生物力学结果显示，在术后4、8周实验组的最大拔出载荷明显高于对照组，表明BMSCs能够促进骨隧道内腱骨结合部早期愈合，提高腱骨愈合的质量，明显增强了腱骨结合部的力学性能。作者推测，在骨隧道内腱骨结合部特定的微环境和特定的细胞外基质刺激下，移植的BMSCs可向特定方向扩增分化为腱骨特异性细胞并合成相应的细胞外基质，促进该部位的愈合，提高该部位的力学性能。

　　本实验选用DiI、SPIO对BMSCs进行双重标记。DiI(化学名称为1,1’-双十八烷-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐)是一种亲脂性羰花青染料，可进行单层贴壁细胞和悬浮细胞的染色，它易嵌入生物质膜内作侧向扩散运动，从而标记整个细胞膜;还可以通过活体细胞的胞饮作用进入胞浆，标记整个细胞浆。Ponticiello等[9]通过实验表明DiI是一种低细胞毒性，不影响细胞活力、不影响细胞增殖潜能的荧光染料。在实验中细胞标记DiI后荧光显微镜观察结果表明，标记率近100%，证实了它能有效标记干细胞。DiI在水溶液中荧光很弱，但是当其标记到脂性的细胞膜上，荧光很强，即使染料渗漏出死亡的细胞，DiI也不会发出很强的荧光。术后组织冰冻切片荧光显微镜在腱骨结合部观察到红色荧光区域，说明移植的细胞一直存活并分布在腱骨结合部，还可以说明对腱骨愈合起主要作用的是移植的细胞而不是宿主局部的细胞。第8周荧光衰减趋势可能与下列因素有关：(1)荧光的强度随着BMSCs移植后在局部不断的扩增分化而逐渐减低;(2)荧光强度可能随着移植的BMSCs由于某些原因自身凋亡而衰减;(3)荧光染料自身有半衰期。

　　在实验中还使用SPIO标记干细胞，主要是希望通过7.0T MR来活体示踪干细胞。SPIO是一种纳米级粒子,它与细胞共孵育后被细胞吞入进入胞浆而标记细胞。Ju等[10]通过实验表明SPIO对细胞无毒性作用。在实验中细胞内吞SPIO后通过细胞爬片普鲁士蓝染色表明，标记率近100%，表明了它能有效标记干细胞。SPIO低浓度即能显著地造成局部磁场的不均匀，使临近质子在驰豫中很快产生相散，加速了质子去相位过程，缩短了组织的T2值，使组织信号降低而产生较强的T2负性对比效应。但在BMSCs移植术后通过7.0T高场强的MR在T2加权像下却未能明显观察因BMSCs内吞SPIO而引起的低信号改变。作者认为可能的原因是T2加权像下肌腱和SPIO标记的BMSCs都是低信号，难以分别。Modo等[11]发现Gd3+复合物能标记示踪干细胞。Gd3+对比剂能产生T1正性对比效应，肌腱在T1加权像下是低信号，所以T1加权像下两者形成鲜明的对比，在后续的韧带重建模型中将用Gd3+复合物标记BMSCs达到活体示踪干细胞的目的。

　　在实验中作者选用Pluronic F-127为细胞载体，取得良好的效果。Pluronic F-127具有在不同的温度下在固态和液态之间转化的特性，适合注入体内。翟喜成等[12]通过实验证实了Pluronic F-127具有良好的生物相容性，无抗原性和免疫原性。

　　综上所述，通过对大鼠关节外骨隧道内腱-骨模型的研究表明，移植的骨髓间充质干细胞可以促进骨隧道内腱骨结合部早期的愈合，DiI可以标记并示踪BMSCs在宿主体内的存活及分布情况。

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作者单位：东南大学附属中大医院骨科，江苏 南京 210009