供体神经雷公藤预处理对异体移植后神经再生的影响

【摘要】  　　目的 探讨雷公藤多甙(雷公藤提取物)或MEM预处理的供体坐骨神经对异体周围神经缺损修复的影响。[方法]用新鲜异体坐骨神经移植(A组)或雷公藤多甙(B、C组)/MEM(D、E组)预处理的Wistar大鼠坐骨神经，桥接SD大鼠10 mm坐骨神经缺损，术后以雷公藤多甙治疗5周：A、C、E组5 mg/(kg·d)，B、D组2.5 mg/(kg·d)。术后2周观察移植物炎症反应情况，12周电生理检测和组织学观察神经再生，16周观察靶肌肉运动终板。[结果]术后早期炎症反应D组比其它组严重;运动神经传导速度、动作电位潜伏期，再生有髓神经纤维数量和轴突直径、髓鞘厚度，C组优于A、B、E组(P<0.05)，A、B、E组则优于D组(P<0.05);运动终板染色着色和数量，D组明显比其它组差。[结论]供体神经经雷公藤多甙预处理可能降低了神经组织免疫原性，异体移植后能促进神经再生，减少移植后受体免疫抑制剂用量。

【关键词】  雷公藤多甙 神经移植 同种异体 预处理 神经再生

　　Effects of donor nerve pretreated with tripterygium wilfordii on neural regeneration after allograft∥HUANG Yingru, JIANG Dianming, CHEN Lu, et al. Department of Orthopaedics, the Traditional Chinese Medical College of Chongqing Medical University, Chongqing 401331, China

　　Abstract：To investigate the repairing effects of pretreated donor sciatic nerve with Tripterygium glycoside(TG) or minimum essential media (MEM) on peripheral nerve defect.SD rat’s sciatic nerve 10 mm gap was repaired by Wistar rat’s fresh sciatic nerve(Group A ) or TG pretreated sciatic nerve(Group B and C)/ MEM pretreated sciatic nerve(Group D and E). SD rats were given TG for 5 weeks after operation, Groups A, C and E were given 5 mg/(kg·d) and Groups B and D were given 2.5 mg/(kg·d). At 2 weeks after operation, inflammatory reaction of the allografts was observed ，the regenerated nerves were observed by electrophysiological and histological tests at 12 weeks after operation, and the motor end plates were observed at 16 weeks after operation.At postoperative initial stage, the inflammatory reaction in Group D was more severe than those in the other Groups. Group C had more significant differences in the conduction velocity, the latent period of motor nerve, the number of regenerated myelinated nerve fibers, the axon diameter and the thickness of myelin sheath than Groups A, B and E (P<0.05), and Groups A, B and E were more significant than Group C (P<0.05). The motor end plates of Group D were worse than those of the other Groups.The immunogenicity of pretreated donor sciatic nerve using TG may be decreased. It could promote neural regeneration and reduce dosage of immunosuppressant of recipient after nerve allograft.

　　Key words：tripterygium glycoside(TG); nerve transplantation; allograft; retreatment; neural regeneration

　　自体神经移植由于神经来源有限，增加创伤和出现新的神经功能障碍区，而同种异体神经与自体神经组织结构相同，应是自体神经较理想替代品，但异体神经移植存在排斥反应。中药雷公藤具有抗排斥反应作用，能保护小鼠异体移植心脏，减少移植物中炎症细胞浸润[1]，下调抗原呈递细胞(APC)膜表面主要组织相容性抗原复合体(MHC)分子和共刺激分子表达，削弱APC抗原提呈功能和对T淋巴细胞的激活作用[2，3]。同种异体周围神经移植后服用雷公藤制剂，神经功能恢复良好[4];供体皮肤用雷公藤制剂预处理后行同种异体移植，其排斥反应减轻，移植皮肤存活时间延长[5]。本实验建立大鼠同种异体坐骨神经移植模型，观察供体神经经雷公藤多甙预处理和MEM预处理对异体神经移植后神经再生的影响有无差别，并探讨供体神经预处理对异体移植后受体免疫抑制剂用量的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　成年健康Wistar大鼠为供体，受体选择成年健康SD大鼠，供、受体均为雄性(重庆医科大学实验动物中心提供)，体重200～250 g。取受体60只，用随机数字表法分成A、B、C、D、E组，每组12只，A组为新鲜异体坐骨神经移植，B、C组为供体神经经雷公藤多甙预处理后再移植，D、E组为单纯细胞培养基(MEM)预处理后移植。术后次日服用雷公藤多甙5周：A、C、E组5.0 mg/(kg·d)，B、D组2.5 mg/(kg·d)。

　　1.2 雷公藤多甙溶液配制与供体神经预处理

　　取400 mg雷公藤多甙片，碾为细末溶于1 000 ml 细胞培养基—MEM中，并依次加入谷胱甘肽(还原型)0.31 g、羟乙基哌嗪乙磺酸3.57 g，反复搅拌密封置4℃～5℃冰箱中过夜，微孔滤膜(0.22 μm)抽滤除菌，制成含雷公藤多甙400 mg/L的预处理溶液，渗透压(300±10)mmol/L，pH值7.30±0.10。无菌条件下，用消毒剃须刀切取供体坐骨神经20 mm长，生理盐水冲洗，立即置于已预冷的雷公藤多甙溶液或MEM溶液(除不含雷公藤多甙外，其余成分均与雷公藤多甙溶液相同)中， 在4℃～5℃冰箱中保存24 h备用。

　　1.3 手术方法

　　采用3.5%水合氯醛腹腔麻醉，右股后外侧纵行切口，上起骨盆后缘，长约30 mm左右，沿肌间隙钝性分离，将股外侧肌、外展短肌与股二头肌分开，显露坐骨神经。距梨状肌下孔5 mm处，用消毒剃须刀片整齐切除大鼠坐骨神经形成10 mm缺损。将新鲜或经预处理的供体坐骨神经修成10 mm长，在10倍手术显微镜下，吻合SD大鼠坐骨神经10 mm缺损，用10-0尼龙线行神经外膜无张力间断缝合4～6针，逐层缝合切口。手术1人完成，术后大鼠不做特殊处理。

　　1.4 观测指标与方法

　　1.4.1 大体观察 观察术后进食、肢体功能变化和溃疡发生情况，术后12周取材时观察移植神经肿胀情况及与周围组织的粘连情况等。

　　1.4.2 神经电生理检测 移植术后12周，每组随机取8只大鼠，腹腔麻醉后显露坐骨神经，刺激电极置于近端吻合口以近约2 mm左右，接收电极置于腓肠肌，地线刺入两电极之间的股二头肌，用BL-410生物机能实验系统，测定神经动作电位潜伏期和传导速度。

　　1.4.3 组织学检测 2周时，每组随机取2只大鼠，切取移植神经中段，石蜡包埋切片厚5 μm，行HE染色，光镜观察移植物入侵炎症细胞。12周电生理检测后，每组随机取6只大鼠(其余2只电镜检查)，移植神经中段行HE染色、光镜(400倍)观察并照相，用ImagePro Plus v5.2图像处理系统分析再生有髓神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度;切取移植神经中段，立即置预冷的2.5%戊二醛溶液中4℃下预固定，1%锇酸后固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀—柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察再生轴突超微结构。

　　1.4.4 靶肌肉运动终板观察 术后16周，新鲜的移植侧腓肠肌中上部分经液氮冷冻后，恒冷箱连续切片5 μm厚，用KarnovskyRoots亚铁氰化铜法显示骨骼肌乙酰胆碱酯酶(AchE)，每个标本随机抽取2张切片，每组共4张，光镜下观察AchE阳性反应沉淀情况。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS 12.0统计软件进行处理，所有数据以±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较用q检验，以P<0.05有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 大体观察

　　术后均出现右后肢瘫痪，足趾并拢、拖步行走。10周左右动物行走跛行减轻，后蹬有力，但D组大鼠跛行仍较明显，观察期间无溃疡、伤口感染和死亡。术后12周D组移植段神经与周围组织粘连明显，远近端吻合口形成轻度膨大(神经瘤)，其余组移植段神经与周围组织轻微粘连，吻合口未见神经瘤。

　　2.2 移植物光镜观察

　　术后2周HE染色发现，D组入侵移植神经的炎症细胞明显比其它组多、炎症反应更重(图1、2)，C组炎症反应最轻，而A、B、E组则相似。

　　2.3 神经电生理

　　术后12周，再生神经动作电位潜伏期和神经传导速度，A、B、E组与C组比较有统计学差异(q=2.93～4.57，3.71～4.68;P<0.05)，与D组比较也有统计学差异(q=3.08～4.45，3.61～4.72;P<0.05)，而A、B、E三组间无差异(q=0.87～1.83，0.61～1.92;P>0.05)，结果见表1。表1 术后12周神经电生理检测组别潜伏期

　　2.4 再生轴突图像分析

　　移植神经中段组织HE染色光镜照片(400倍)，经图像分析系统分析发现，再生有髓神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度，A、B、E组与C组比较有统计学意义(q=3.19～4.76，3.37～4.11，2.95～3.91;P<0.05)，与D组比较同样有统计学意义(q=3.12～4.29，3.06～4.42，3.28～4.06;P<0.05)，而A、B、E 3组间无差异(q=0.95～1.30，0.72～1.51，0.84～1.34;P>0.05)，结果见表2。表2 术后12周再生神经纤维图像分析组别神经纤维数

　　2.5 电镜观察

　　移植术后12周，A、B、C、E组再生神经纤维中，可见较多有髓神经纤维和少量无髓神经纤维，髓鞘发育良好，呈同心圆排列，轴浆内微丝、微管和线粒体等细胞器丰富;D组再生神经纤维中，有髓神经纤维较少，而无髓神经纤维较多，神经纤维间可见增生的结缔组织(图3、4)。

　　2.6 靶肌肉运动终板

　　光镜下正常运动终板AchE阳性区呈棕红色或深棕色的“梅花形”或“卵圆形”，直径25～30 μm，结构清楚、边缘光滑，着色深。神经移植后16周，A、B、C、E组的终板接近正常，外形较大且规则，数量较多，呈深棕褐色(尤其C组最好);而D组终板形状较小且数量少，着色较浅(图5、6)。

　　图1 术后2周B组移植段神经组织学变化 HE×400 图2 术后2周D组移植段神经组织学变化 HE×400 图3 术后12周B组再生神经超微结构(箭头所示有髓神经纤维) 图4 术后12周D组再生神经超微结构TEM×10 000(箭头所示有髓神经纤维) TEM×10 000 图5 术后16周B组运动终板(箭头所示AchE阳性区)KarnovskyRoots法×400 图6 术后16周D组运动终板(箭头所示AchE阳性区)KarnovskyRoots法×400

　　3 讨 论

　　异体神经移植的主要问题是排斥反应，MHC是移植免疫病理的核心，其中MHC-II是APC呈递抗原的关键分子，然而周围神经组织的雪旺氏细胞(SCs)、神经外膜和束膜细胞、血管内皮细胞等都能表达MHC-II分子。为了克服异体神经移植后宿主的排斥反应，除术后对宿主进行免疫抑制治疗外，人们探索用不同方法(物理或化学法)对供体神经进行预处理，灭活或清除神经组织细胞成分，以降低异体神经的免疫原性，而引导轴突再生并起支架作用，具有三维空间结构的基膜管保持不变[6～8]。然而，SCs是周围神经的主要结构与功能细胞，在轴突再生与髓鞘形成、神经营养因子(NTFs)和黏附分子以及细胞外基质的合成与分泌均极为重要，灭活、清除SCs势必会影响轴突再生，而在去细胞异体神经移植物内种植SCs后则促进神经再生[9]。

　　在本实验中，雷公藤多甙(B、C组)/MEM(D、E组)预处理的大鼠坐骨神经异体移植后服用不同剂量的雷公藤多甙，术后2周D组的炎性细胞入侵明显要比其它组严重，而移植后12周电生理和组织学检测、16周靶肌肉运动终板染色，均显示D组要比其它组差，C组最好，A、B、E组差别不明显。其原因可能是：(1)雷公藤多甙预处理后，降低了供体坐骨神经的免疫原性，而神经组织结构未受影响，异体移植后免疫反应减轻，有利于少量入侵的炎症细胞产生促进SCs增殖分化的细胞因子，而SCs增殖并形成Bungner带是新生轴突得以延长进入移植段神经、并最终能到达靶器官的前提。而MEM预处理神经组织免疫原性未发生改变，因而异体移植后D组与A、B、C组相比，出现大量单核细胞、淋巴细胞入侵移植物，入侵的炎症细胞将SCs作为抗原清除，破坏移植物的组织结构，神经基膜管塌陷，成纤维细胞增殖，纤维结缔组织增生，影响了再生轴突通过。而雷公藤能抑制成纤维细胞增殖和胶原纤维的合成[10]，故E组在D组基础上，增加术后雷公藤多甙剂量，其效果则明显好于D组，与A、B、C组相似，神经再生情况良好，未见明显结缔组织增生;(2)预处理后SCs仍具生物活性[11]，功能正常的SCs能分泌多种NTFs与黏附分子，且具有神经趋化性，能引导轴突生长锥生长[12]。移植物上具生物活性的SCs继续发挥促进轴突再生的作用，但是D组在预处理后未改变移植神经的免疫原性，术后免疫抑制剂用量偏低，SCs被排斥而影响了神经再生;(3)供体神经组织所吸收的预处理溶液中的药物成分，在异体移植后的一定时间内发挥了免疫抑制作用，从而降低术后免疫抑制剂用量。

　　供体神经雷公藤多甙预处理与受体服用免疫抑制剂，可能有协同作用，异体移植后能促进神经再生并降低术后免疫抑制剂用量，这对临床减轻或避免全身大剂量免疫抑制剂所引起的毒副作用有重要意义。当然，预处理溶液中雷公藤多甙最佳浓度与处理时间，这种方法对供体神经免疫原性具体影响、对生物体安全性的影响等还需要进一步研究。

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作者单位：重庆医科大学 a.中医药学院骨科教研室，重庆 401331;b.附属第一医院骨科，重庆 400016