人脐血单个核细胞促进脊髓损伤后的轴突再生

【摘要】  [目的]讨论人脐血单个核细胞(human cord blood mononuclear cells，HCMNCs)移植治疗大鼠脊髓损伤后损伤区域轴突再生情况和功能恢复。[方法]利用 Impactor Model Ⅱ打击器制成30例T10脊髓损伤模型，分组为：实验对照组(DMEM细胞培养基)，损伤后3 d HCMNCs移植组，损伤后14 d HCMNCs移植组，每组10例。以HE染色和免疫组化染色以及BDA顺行示踪染色观察脊髓损伤处轴突再生情况，结合对各组实验动物脊髓损伤后肢体功能的恢复情况进行行为学评分(BBB 评分)，综合评估脊髓功能恢复程度。[结果]与对照组比较，HCMNCs移植治疗能够明显促进神经轴突再生，改善功能恢复，损伤后14 d HCMNCs移植组优于损伤后3 d移植组，各组间疗效差异具有统计学意义(P<0.01)。[结论]HCMNCs在体内向神经元及神经胶质细胞分化，促进神经轴突再生和功能恢复。损伤后14 d是移植的较为理想的时间。

【关键词】  脊髓损伤; 细胞移植; 人脐血单个核细胞; 轴突再生

Human cord blood mononuclear cells in promotion to axonal regeneration of injured spinal cord∥NING Guangzhi,FENG Shiqing，BAN Dexiang，et al.Department of Orthopedics of Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

　　Abstract：To discuss axonal regeneration and functional recovery after rat's spinal cord injury with transplantation of human cord blood mononuclear cells (HCMNCs).Thirty injured spinal cord models of Wistar rat were made with Impactor ModelⅡat T10 and then divided into 3 groups randomly and evenly(DMEM control,HCMNCs grafted 3 days post injury and HCMNCs grafted 14 days post injury).Hindlimb functional recovery of rats in each group was evaluated by BBB locomotor functional scale.HE,immunohistochemistry staining,and BDA anterograde tracing were used to observe the axonal regeneration in the lesion site.Compared with control group,grafted HCMNCs exerted larger effect on promoting nerve regeneration and functional recovery.Rats in the group of HCMNCs grafted 14 days postinjury had better functional recovery than those in HCMNCs grafted 3 days postinjury group.Statistic difference existed among three groups (P<0.01).HCMNCs differentiated into neurons and glial cells in vivo,which promoted axonal regeneration and functional recovery after SCI.Forteen days after injury was the ideal time for cell transplantation.

　　Key words：spinal cord injury; cell transplantation; human cord blood Mononuclear cells (HCMNCs); axonal regeneration

　　脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的治疗困难且致残率高，对人类的生命和健康构成极大威胁。细胞移植可以通过改变SCI后的病理过程从而促进脊髓功能恢复，其中干细胞移植是当前的热点。与其它来源干细胞相比，HCMNCs来源丰富，取材方便，无任何生理与伦理问题，且有较强的增殖分化能力;其低免疫应答性使得同胞间或非血缘供者移植后的急、慢性移植物抗宿主病的发生率低且程度轻[1]。因此作者拟在脊髓损伤后不同时间将HCMNCs植入损伤部位，观察脊髓损伤处轴突再生情况，并结合BBB评分，评估脊髓功能恢复程度，探讨治疗SCI的新方法，并观察HCMNCs植入较为理想的时间，为临床应用提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 组织来源 健康成年Wistar大鼠30只(雌性，8周龄，体重200±30 g，由协和医科大学放射医学研究所动物实验中心提供)。

　　1.1.2 实验设备 Impactor Model Ⅱ打击器;超净工作台(天津医药设备厂);CO2培养箱(NAPCO 5410，USA);荧光倒置显微镜(OLYMPUS BX-60，Japan);恒温冰冻切片机(LEUCER，USA);5 μl Hamilton微量注射器(上海精密仪器厂)。

　　1.1.3 实验试剂 DMEM培养液(GIBCO，USA);胎牛血清(天津市北辰盛达生物制品厂);将上述2种试剂按4∶ 1配制成含有20% FCS的DMEM培养液作为培养基;NF200(Uscnlife，USA);生物素标记的葡聚糖胺BDA(Vector Lab Co，USA); Hoechst 33342(碧云天生物技术研究所)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验分组 30只Wistar大鼠随机分为3组，每组10只： DMEM实验对照组(DMEM组);损伤后3 d HCMNCs移植组(HCMNCs-3组);损伤后14 d HCMNCs移植组(HCMNCs-14组)。

　　1.2.2 HCMNCs的制备 严格无菌条件下肝素抗凝采集健康、自然分娩产妇志愿捐献脐血(检测乙肝5项、HCV、HIV、梅毒阴性)50～180 ml，充分混匀，4℃ 冷藏，4～6 h内进行分离。根据Ficoll法，在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。取脐血与等量DMEM液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，保持清楚的界面。水平离心2 000 r/min×30 min。离心后管内分为3层，上层为血浆和DMEM液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的DMEM液，1 500 r/min×10 min，洗涤细胞2次供以后的移植实验使用(图1a)。将制备的HCMNCs与DMEM按体积1∶2 混合。细胞计数为1.5×106/ml ,台盼蓝计数存活率约为95%。

　　1.2.3 移植物的标记 移植前用荧光染料Hoechst 33342(10 μg/ml)标记HCMNCs 1h(图1b),反复以DMEM洗涤后以备植入脊髓，观察移植物植入位置及存活情况(图1c)。

　　图1a 制备的HCMNCs(×100) 图1b 标记后的HCMNCs(×250) 图1c 标记后的HCMNCs植入脊髓损伤区(×100)

　　1.2.4 SCI动物模型的制备 实验动物麻醉后取俯卧位,固定在手术台上,备皮、消毒后,以T10为中心纵行切开背部皮肤及皮下组织,剥离两侧椎旁肌,暴露并咬除T10棘突及椎板,显露硬膜。以Impactor Model Ⅱ脊髓打击器,25 mm 高度、10 g重量,自由落体打击。将脊髓打击后的动物放置于麻醉复苏笼内饲养24 h ,复苏清醒后由专人喂养,自然光照,饮水不限,每天挤压排尿。DMEM组大鼠SCI造模术后3 d按以上步骤将DMEM液注入SCI损伤区。

　　1.2.5 HCMNCs的植入 大鼠SCI造模术后，分别将制备好的HCMNCs悬液按实验分组在3、14 d后按以下步骤进行脊髓移植手术：手术入路同动物模型制作,显露硬膜,汉密尔顿单细胞注射器垂直刺入损伤中心,缓抽少量渗液后,分别按实验组于损伤中心的头尾斜角45°注入10 μl已制备的HCMNCs悬液。观察无渗出后逐层缝合,复苏清醒后由专人喂养。

　　1.3 疗效评定

　　1.3.1 BBB评分 由2位未知情者分别对实验动物按照BBB评分标准通过观察后肢恢复情况，包括关节运动，行走能力，协调性和肢体稳定性进行评分。移植前和移植后1周开始每周进行评分,至术后8周。

　　1.3.2 术后12周进行HE染色和NF-200免疫组化染色。

　　1.3.3 BDA顺行神经示踪染色 术后12周,向大脑两侧的感觉运动区皮质内注射质量浓度10% BDA。2周后再次麻醉动物,尽快暴露并取出T4～L1节段脊髓,标记损伤中心及头尾、腹背侧,放入50%的葡萄糖试管内,4 ℃冰箱过夜保存,次日冰冻切片。于-18℃下包埋后做5 μm 厚横断面及冠状面冰冻切片,分别进行BDA显影。

　　1.4 数据及图像统计分析

　　SPSS 13.0统计软件作为数据处理平台，结果以(±s)表示;3组实验大鼠BBB评分采用方差分析(ANOVA)及SNKq进行组间的两两比较;免疫组化染色的数字图像经Image pro plus 5.0显微图像分析软件处理。

　　2 实验结果

　　2.1 SCI动物模型

　　术前大鼠健康有活力，行动敏捷。术后3组大鼠苏醒后均出现双侧后肢瘫痪。移植后所有动物均存活至实验结束。

　　2.2 HCMNCs植入位置及存活情况

　　Hoechst是一种非毒性的核标记染料，标记持续时间长[2]。由于在脊髓损伤中心部位形成空洞，故作者避开损伤中心而在其头尾两端约2 mm处植入细胞。1个月后仍可见被标记的细胞在脊髓内存活。

　　2.3 BBB评分

　　术前所有实验动物双后肢BBB评分均为21分(图2a)。造模术后所有动物均呈现双后肢瘫痪，BBB评分均为0-1分(图2b)，移植术后BBB评分逐渐上升，至移植术后8周时HCMNCs-14组可达14分左右(图2c)。移植术后2周内的BBB评分各组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，第3周后的BBB评分各组之间的差异有统计学意义(P<0.01)，其中HCMNCs移植组明显高于DMEM空白对照组，尤以损伤后14 d HCMNCs移植组明显，损伤后3 d HCMNCs移植组次之(表1)。表1 脊髓损伤后各组BBB评分随时间变化情况

　　2.4 HE染色

　　DMEM实验对照组脊髓空洞面积大，神经纤维稀疏，大量胶质细胞聚集形成瘢痕。HCMNCs-14组可观察到脊髓空洞明显小于其它组，损伤移植区有来自宿主的神经纤维，移植中心有成活的神经细胞大量轴突长入移植物，融合较好(图3)。

　　2.5 NF-200免疫组化染色

　　HCMNCs移植组免疫组化染色较DMEM实验对照组面积为大，且着色较深，表明移植组的轴突密度较对照组高，其中又以HCMNCs-14组为高(图4)。采用Image pro plus 5.0显微图像分析软件分别对每组的横断面切片进行分析，测定其免疫染色强度，以累积光密度(IOD)为衡量指标，发现：HCMNCs移植组IOD值明显高于DMEM空白对照组，HCMNCs-14组IOD值高于HCMNCs-3组，统计学分析有显著性差异(P<0.01)(表2)。

　　表2 各组横断面切片NF-200免疫组化染色累积光密度

　　(IOD)比较(±s)组别n±sDMEM组58819.36±420.99HCMNCs-3组520606.19±1015.20HCMNCs-14组526801.27±1399.76F值395.19P<0.01

　　2.6 BDA顺行神经示踪

　　在DMEM实验对照组中,位于脊髓白质后索中的皮质脊髓束纤维在脊髓损伤处染色少，在HCMNCs-14组中,皮质脊髓束纤维染色相对较多(图5)。

　　3 讨 论

　　脊髓损伤治疗目前是医学界需要攻克的一个难点，原因是神经元功能性突触联结难以重建，神经功能将会永久性丧失。修复脊髓损伤的实验研究主要包括：细胞移植，减少瘢痕和空洞，补充神经营养因子，减少抑制性因子，改善轴突再生的微环境等。细胞移植治疗脊髓损伤的原理主要为：(1)通过细胞移植填充脊髓缺损，消除胶质瘢痕、细胞碎片等机械屏障，桥接空洞区，为神经元的再生提供一个细胞生长和附着的场所;(2)保护神经元，减轻继发损伤，修复神经通路;(3)移植细胞提供促进轴突再生的各种细胞因子(Cytokines)，如神经营养素(neurotrophin，NT)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等[3]。

　　干细胞移植技术是当前的热点[4]。近年来国内外学者在研究中应用胚胎干细胞、神经干细胞[5]、骨髓基质细胞[6]等单独或与其他细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤，取得了一定的效果，但在真正应用于临床时将要面对取材相对困难、伦理、免疫排斥反应等一系列问题。与之相比，脐血干细胞的来源和性质使其避开了上述问题，其主要优点包括：来源丰富，取材方便;无任何生理与伦理问题;具有较强的增殖分化能力和良好的可塑性;具有对病变部位的“趋化性”;脐血干细胞的低免疫应答性使得同胞间或非血缘供者移植后的急、慢性移植物抗宿主病的发生率低且程度轻，这使其成为脊髓损伤治疗理想的种子细胞来源。

　　图3 HE染色(×100) 图3a DMEM实验对照组:脊髓空洞面积大，神经纤维稀疏，大量胶质细胞聚集形成瘢痕 图3b HCMNCs-3组:可观察到脊髓空洞较DMEM实验对照组减小，损伤移植区有来自宿主的神经纤维 图3c HCMNCs-14组:可观察到脊髓空洞明显小于其他组，损伤移植区有来自宿主的神经纤维，移植中心有成活的神经细胞大量轴索长入移植物，融合较好 图4 NF-200免疫组化染色(×400) 图4a DMEM实验对照组 图4b HCMNCs-3组 图4c HCMNCs-14组 图5 BDA顺行神经示踪(×250) 图5a DMEM实验对照组:位于脊髓白质后索中的皮质脊髓束纤维在脊髓损伤处染色少 图5b HCMNCs-3组:皮质脊髓束纤维染色较DMEM实验对照组多 图5c HCMNCs-14组: 皮质脊髓束纤维染色较其他组明显增多

　　脐血干细胞在体内或体外一定条件下可以向神经元和神经胶质细胞分化。Ha等[7]分离人脐血单个核细胞在体外用β2巯基乙醇、多聚左旋赖氨酸诱导分化,5 d后可观察到有些细胞有细胞质突起形成,并逐渐从集落中迁移出来,20 d后,可见细胞形成长的细胞质突起,其中一些细胞形成多个突起,显示成熟神经元的形态,免疫组化可见神经元特异性核蛋白(neuN)，神经丝(neurofilament) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 阳性细胞,10%以上细胞神经丝反应强阳性。Buzańska等[8]研究证实脐血干细胞在多种生长因子作用下或与大鼠脑共培养时可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。Dasari等[9]证实在体外实验中，脐血干细胞向神经元(约46.3%)分化相对较多，星形胶质细胞(约17.2%)和少突胶质细胞(约36.5%)较少，而在脊髓损伤的体内实验时星形胶质细胞(约16.0%)和少突胶质细胞(约46.2%)是分化的主要去向，神经元(约37.8%)相对较少。

　　通过本实验发现：移植后2周内，各组功能改善的差异没有统计学意义;3周以后各组之间的差别才具有统计学意义，其中HCMNCs移植组(包括HCMNCs-3组和HCMNCs-14组)实验动物BBB功能评分明显高于DMEM空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。组织学观察神经轴突再生情况与功能学检查的结果相吻合。考虑脐血干细胞可能主要是通过以下几个方面发挥其在脊髓损伤治疗中的作用：(1)脐血干细胞在体内的分化去向中，约37.8%形成新的神经元，从而在脊髓损伤部位填充组织空洞;(2)在受损脊髓部位存在大量脱髓鞘但却基本完整的轴突，脐血干细胞分化形成的少突胶质细胞可使这些轴突再髓鞘化，以恢复其正常的神经传导功能;(3)分化形成的少突胶质细胞还可以在损伤部位分泌脑源性神经营养因子(brainderived neutrophic factor，BDNF)、神经营养素3(neurotrophic3，NT3)，两者可以促进轴突再生。

　　脊髓损伤后细胞移植时间目前尚存在争议。通过实验作者发现：移植后3周以后，HCMNCs-14组BBB功能评分明显高于HCMNCs-3组，差异有统计学意义(P<0.01)。在脊髓损伤急性期，损伤部位多种炎性细胞因子水平急剧上升，包括白介素-1(interleukin-1，IL-1)，白介素-6 (IL-6),以及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等[10]，这些细胞因子都具有神经毒性作用，故急性期在损伤区微环境中移植脐血干细胞成活率较低，效果不佳。而损伤后2周急性炎症期已经结束，进入修复塑形期，生长因子和营养因子开始表达，微血管再生，此时的微环境利于脐血干细胞在局部存活并向神经元和神经胶质细胞分化[11]，从而在损伤后2周移植脐血干细胞能够促进神经轴突再生，明显改善功能恢复。

　　作者的研究表明，人脐血干细胞移植治疗能够明显促进神经轴突再生，改善功能恢复。损伤后14 d是移植的较为理想的时间。同时，尚有一些问题有待于解决，如脐血单个核细胞成分复杂，包括单核细胞和淋巴细胞等，在分化和促进脊髓损伤修复的过程中，究竟是某一群细胞发挥作用还是多群细胞协同作用，如何能够更好的调节人脐血干细胞在体内分化为神经细胞和神经胶质细胞的比例，使之更有利于脊髓损伤的恢复，这些问题需要进一步研究。

【参考文献】
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　　[9] Dasari VR,Spomar DG,Gondi CS,et al.Axon remyelination by cord blood stem cells after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2007,2:391-410.

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作者单位：天津医科大学总医院骨科，天津 300052