神经组织工程修复脊髓损伤中的种子细胞

【摘要】  脊髓损伤后局部产生的各种抑制因子以及神经断端之间的瘢痕都是脊髓损伤难以修复的重要原因。通过细胞移植不仅可以补充局部损失的细胞，而且可以促进损伤脊髓功能的恢复。本文对脊髓损伤修复中的各种常见种子细胞进行了综述，并对各种细胞的优缺点进行了讨论。最后根据目前的研究现状，对细胞移植治疗脊髓损伤的研究趋势进行了展望。

【关键词】  脊髓损伤； 组织工程； 神经组织； 种子细胞； 修复

 Seed cells in neurotissue engineering on repairing spinal cord injury∥ZENG Hanbing, LI Shi, LI Wanli,et al.The Second Affiliated Hospital, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325027, China

    Abstract：The inhibitory environment and loss of axonal connections after spinal cord injury pose  many obstacles to regenerating the lost tissue．Cellular therapy provides a means of restoring the cells lost to the   injury and could potentially promote functional recovery after such injuries．This review presents a summary of   the various types of cellular therapy used to treat spinal cord injury.A wide range of cell types have been   investigated for such uses and the advantages and disadvantages of each cell type are discussed along with the   research studying each cell type．Based on the current research，suggestions are given for future investigation of   cellular therapies for spinal cord regeneration．

    Key words：spinal cord injury;  tissue engineering;  neuro tissue;  seed cells;  repair

   脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重危害人类健康的疾患，其具有高发生率、高致残率及高医疗耗费等特点，现已成为全球性的医疗难题。传统的治疗方法对于已损伤脊髓的治疗效果尚不满意［1］。近年来，随着神经组织工程技术的飞速发展，利用组织工程细胞移植修复神经损伤成为可能，其为脊髓损伤治疗提供了新的思路。神经组织工程即应用组织工程学原理和技术方法构建组织工程化的具有生物活性的神经替代物，其核心技术是在种子细胞和生物支架之间构建一活性微环境，从而达到促进神经修复的目的。本文就神经组织工程修复脊髓损伤中种子细胞的研究进展及应用前景作一简要综述。

    采用细胞移植治疗脊髓损伤的主要目的是为再生轴突提供支架，分泌各种营养因子从而促进轴突生长，替代损伤缺失的细胞和组织。其可能的机制为：(1）桥接脊髓损伤断端，形成功能性突触，重新建立神经传导通路；(2)分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，从而促进轴突的再生；(3)使损伤的脱髓鞘轴索再髓鞘化，恢复有髓神经的电传导功能。目前研究的热点有神经干细胞、胚胎干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞及骨髓间充质干细胞等，它们均被证明用于构建组织工程化神经移植细胞时，可以促进受损脊髓功能得到不同程度的恢复。

    1  神经干细胞(neural stem cells，NSCs)

    神经干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞，能分化成各种神经系统的细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，而且具有自我更新和维持的能力，并具有一定的迁移能力，能到达损伤或疾病部位并产生新细胞。NSCs主要来源于胚胎或成年哺乳动物中枢神经系统的不同部位(包括海马齿状回颗粒下层、侧脑室及脊髓的室管膜以及皮质及杏仁核等部位)［2］。神经干细胞移植治疗脊髓的机制可能为：(1)补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞，为损伤脊髓重新建立传导通路，形成功能性突触，同时产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后遗留的空腔，为再生的轴突提供支持物;(2)NSCs分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，使损伤轴突开始再生;(3)使残存脱髓鞘的神经纤维形成新的髓鞘，保持神经纤维功能的完整性［3］。Lepore等［4］将从大鼠胚胎脊髓组织分离的脊髓NSCs植入脊髓损伤模型15个月后，通过人胎盘碱性磷酸酶免疫染色证实移植的神经干细胞向神经元分化，并且电镜观察发现新生神经元与宿主神经元间有新建立的突触。运动学检测表明，移植组大鼠前肢运动功能得到了明显的改善，但与正常动物仍有一定差距。Tarasenko等［5］以重物打击造成大鼠T10脊髓损伤模型，将抗原预处理过的人胚胎来源的NSCs移植入损伤部位，通过组织学切片及大鼠功能恢复评价分析，发现在损伤3个月后，移植处的NSCs能正常存活，大鼠的运动功能得到了很大程度的恢复。采用基因治疗手段修复脊髓损伤是目前的热点。Wang等［6］将NT3基因逆转录至病毒构建载体，经筛选阳性细胞克隆后转染入NSCs，通过RTPCR、Western杂交法、免疫化学等方法证实了NT3合成量明显增加，证明应用NT3  eDNA对中枢神经系统损伤的基因治疗是可行的。上述研究结果均表明神经干细胞移植在修复脊髓损伤和改善自体运动功能方面具有肯定疗效。此外，由于神经干细胞通常取材于患者自身，可以较好地解决其他类型的异体干细胞难以回避的个体排斥问题。NSCs分离和培养的成功，尤其是采用编码致癌蛋白的外源性遗传信息使NSCs永生化，解决了移植物数量不足的问题，也避免了伦理学方面的问题。因此，理论上神经干细胞是移植替代治疗的首选干细胞类型。然而，动物实验发现，在受损脊髓内炎症细胞因子的作用下，NSCs植入体内后不再分化或仅向星形胶质细胞分化从而参与瘢痕组织形成，而且脊髓的微环境仅适合NSCs分化为胶质细胞而不利于其分化为神经元，因此如何将NSCs定向分化为神经元也是一个难题。另外，NSCs取材来源有限，获取材料时手术具有侵袭性，难以获得患者的认同，也限制了NSCs直接应用于临床。

    2  胚胎干细胞(embryonics tem cells，ESCs)

    胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群（ICM)和原始生殖细胞经体外分化、抑制培养并分离克隆出来的一种原始、高度未分化细胞。ESCs在体外培养系统中可扩增并可维持其全能性。胚胎干细胞还能广泛参与宿主胚胎各组织、器官生长发育，形成嵌合体。Hamada等［7］利用MASH1基因导入ESCs后不表达Nogo受体的特点，将该细胞移植入大鼠脊髓损伤模型后，通过绿色荧光蛋白(GFP)标记细胞观察到ESCs能显著促进轴突的生长，电生理检测发现大鼠下肢的运动功能有明显改善。Deshpande等［8］将ESCs来源的运动神经元移植入下肢瘫痪大鼠的损伤脊髓处，术后发现轴索长入肌肉，形成有效的神经肌接头结合，大鼠的瘫痪也得到了一定程度的恢复。以上研究表明胚胎干细胞主要是通过发挥中继作用修复受损神经元，并使轴突形成完整的神经环路，释放促进神经元再生的营养因子，快速重建轴突的连续性。但是也有学者得出了不同的结论，Cloutier等［9］把来源于人胚胎干细胞的少突胶质细胞分别移植入严重脊髓损伤并出现脱髓鞘及轻度脊髓损伤未出现脱髓鞘的成年大鼠中，通过观察移植细胞的存活、迁移，发现对于轻度损伤未出现脱髓鞘的脊髓，人胚胎干细胞并不能促进髓鞘的再生，提示人胚胎干细胞分化的少突胶质细胞进行移植治疗的先决条件是出现脊髓脱髓鞘。

    目前，胚胎干细胞的临床应用存在颇多障碍，由于采用胚胎干细胞进行临床治疗时必须取材于人类胚胎，有限的来源和取材过程中难以回避的伦理学和法律学问题成为其广泛应用过程中的瓶颈［10］。此外，未分化的胚胎干细胞具有潜在的致瘤效应，且植入成熟中枢神经系统的非神经区后保持不分化或主要向神经胶质细胞分化也是胚胎干细胞移植的一大难题。

    3  嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)

    嗅鞘细胞是一种能够终生有助于嗅神经元轴突生长和再生作用的胶质细胞，它起源于嗅球基底膜，分布在嗅球和嗅神经的最外层［11］。嗅鞘细胞作为脊髓组织工程的种子细胞具有两个明显的优势：(1)既能像雪旺细胞一样存在于外周神经有助于轴突的生长，又能像星形胶质细胞一样存活于中枢神经系统；(2)嗅黏膜和嗅神经具有终生再生的能力，研究发现正是由于嗅鞘细胞的存在，才使得其具有不断再生的能力。自从Li［12］等在1997年首次应用嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤取得满意效果后，嗅鞘细胞现已被广泛应用于各种急性脊髓损伤的动物模型，如脊髓全切、半切、脊髓束损伤等。尹国栋等［13］将人胚胎嗅鞘细胞移植入T10脊髓横断损伤的大鼠体内，采用免疫细胞化学染色、荧光显微镜、大鼠功能BBB评分等指标观察损伤大鼠的恢复情况，结果在术后10周时仍可观察到嗅鞘细胞存活，荧光示踪提示实验组功能神经纤维、神经突触数目和密度均高于对照组，BBB评分在术后6周时显著提高。嗅鞘细胞不但可以促进急性脊髓损伤的修复，而且对于迟发型的脊髓损伤同样有较好的修复作用。Raisman［14］及其团队将嗅鞘细胞悬液单独植入C1单侧皮质脊髓束损伤8周后的动物模型中，结果实验组动物在1～3周后功能得到了明显的恢复，他们认为嗅鞘细胞诱导髓鞘生成是脊髓修复的重要原因。此外，嗅鞘细胞也可以分泌多种神经营养因子，如神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素3(NT3)等，以保护神经元的生存和提供神经轴突生长及髓鞘化所需的细胞外基质［15］。除了拥有良好的脊髓修复能力，嗅鞘细胞还具有取材方便、易于体外纯化和扩增的优点，使其容易在临床推广。Feron［16］及MackaySim［17］等将自体嗅黏膜鞘细胞移植于慢性脊髓损伤患者的Ⅰ期临床实验正在进行中，1、3年的随访结果显示：采取人自体嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的方法是安全、可行的，但临床疗效并没有如脊髓损伤动物模型那样显著，6位完全脊髓损伤(ASIA分级A级)的病人中只有1位病人的感觉功能得到了轻度的恢复，其余病人与术前相比无明显改善。目前，嗅鞘细胞在脊髓损伤中的作用机制、移植细胞的最佳数量和移植方式，以及移植后发挥有效作用的持续时间等，都是尚待解决的问题。

    4  雪旺细胞(schwann cells，SCs)

    雪旺细胞又称神经膜细胞，属于周围神经系统的胶质细胞，它可以在脊髓损伤后自主迁移至受损部位。研究发现雪旺细胞可能通过以下几种机制促进轴突再生而达到修复脊髓的作用：(1)分泌神经黏附分子(NCAM)等细胞黏附分子以及胶原、层粘连蛋白等细胞外基质分子，这些蛋白都有不同程度的支持和促进神经元轴突生长的能力［18］；(2)产生各种神经营养因子(NTFs)，包括成纤维生长因子2(FGF2)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和神经营养素3(NT3)等来促进髓鞘形成［19］。Oudega等［20］将培养后的雪旺细胞移植入脊髓损伤模型中发现雪旺细胞能够促进轴突再生及髓鞘形成，但是由于损伤周围胶质疤痕的抑制作用无法使再生轴突进一步越过移植物与宿主的界面，因此不能与脊髓神经元形成新的突触，相关的功能也不能恢复。Girard等［21］将表达BDNF或NT3的载体(vector)转染雪旺细胞后，将转基因细胞移植到裸鼠脊髓脱髓鞘部位，行为学分析表明转基因雪旺细胞能有效促进裸鼠功能的恢复。雪旺细胞应用于临床的工作也在进行之中。最近，Saberi等［22］报道了将自体人雪旺细胞经分离、纯化后移植入体内治疗慢性脊髓损伤病人的1年随访结果，结果显示只有1位不完全脊髓损伤的患者运动和感觉功能得到了轻度的改善。

    但是对于雪旺细胞移植也有很多争议。雪旺细胞在发育过程中向中枢神经系统的迁移只有在没有星形胶质细胞存在的情况下才可以观察到，且其促髓鞘生成的作用在星形胶质细胞的边缘就被阻止，移植的雪旺细胞不能与星形胶质细胞共存。KeyvanFouladi等［23］的实验表明，雪旺细胞对于大鼠皮质脊髓束的损伤没有明显的修复作用。同时，移植的雪旺细胞在局部的迁移距离非常有限。如何在增加其迁移范围的同时继续保持植入中枢部位后的生物活性等都是尚未解决的问题。

    5  骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)   

     骨髓间充质干细胞又称为骨髓基质干细胞，是存在于成年动物或人骨髓中的非造血组织的一种干细胞。BMSCs是一群具有多向分化潜能的均质性细胞，在特定的诱导条件下可分化为多种间充质细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肝细胞和神经细胞等，并且具有自我更新的能力［24］。骨髓间充质干细胞作为治疗脊髓损伤时的种子细胞具有以下优点：(1)取材方便，培养方法简单；(2)可自体移植，无免疫排斥反应，移植时不涉及伦理道德问题；(3)移植方式比较简便，有学者采用静脉注射的移植方式也取得了比较满意的结果［25］。Satake等［26］将绿色荧光蛋白标志的骨髓间充质干细胞注入脊髓损伤大鼠模型的蛛网膜下腔，1个月后发现大部分移植细胞迁移到病变周围，其中部分移植细胞表达了神经元和神经胶质细胞的标志蛋白，同时大鼠的运动和神经功能得到明显的改善。Ankeny等［27］的实验表明：移植的骨髓间充质干细胞能够促进轴突生长，由BMSCs生长出的轴突也多沿脊髓的纵轴方向生长，提示骨髓间充质干细胞在脊髓损伤部位轴突重建中发挥重要作用。另外，迁移至局部的骨髓间充质干细胞及其分化的神经细胞还可反应性分泌各种神经营养因子，如NGF、BDNF等，达到神经保护，改善局部微环境，从而产生治疗脊髓损伤的作用。采用基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤也是当前研究的一个热点。Lu等［28］将表达NT3的基因修饰BMSCs后，移植入颈髓损伤6周后的成年大鼠损伤部位，3个月后在没有切除损伤脊髓胶质瘢痕的情况下，解剖学研究发现有大量新生轴突形成，NT3浓度较正常脊髓组织高，他们认为NT3基因修饰的骨髓间充质干细胞在修复陈旧性脊髓损伤时发挥着重要作用。目前，骨髓间充质干细胞应用于临床的工作尚处于起步阶段，2006年，Sykova等［29］报告通过椎动脉导管内途径和静脉途径2种移植方式将急性(7例)和慢性脊髓损伤(13例)患者的自体骨髓间充质干细胞移植入患者自体内，采用ASIA评分、Frankel评分、运动、感觉诱发电位及MRI等手段分别于术后3、6、12个月观察疗效，其中5例急性脊髓损伤患者和1例慢性脊髓损伤患者在3个月内恢复了部分运动和感觉功能，2年随访期间所有患者均没有出现任何并发症。因此，Sykova等认为自体BMSCs移植安全、有效，且脊髓损伤后3～4周内为细胞移植治疗的最佳时机，但研究结果仍需要大量的临床病例和进一步随访来证明。和其他类型的干细胞一样，骨髓间充质干细胞在体内的定向分化也受到脊髓病理微环境的影响，也存在定向分化调控的问题。另外，骨髓间充质干细胞在体内的分化率和存活率均很低，如何提高仍有待进一步研究。如何把握骨髓间充质干细胞移植的合适时间和数量，如何进一步提高轴突的再生能力并引导轴突向合适的目标方向生长，也是亟待解决的问题。

    除了前述几种常见的种子细胞，巨噬细胞、脐血干细胞、成纤维细胞、树突状胶质细胞等也是可供选择的移植物。但细胞移植治疗所需的理想细胞量、移植效果的维持时间以及如何应用神经营养因子、免疫抑制剂等一系列问题，还有待于深入的研究［30］。

    6  问题与展望

    综上所述，细胞移植修复脊髓损伤的研究已经取得了长足的发展。但对于临床脊髓损伤的治疗来说，这项工作尚处于起步阶段。因为目前大多数研究还停留在动物实验阶段，如需应用于临床尚有大量的问题需要解决，主要集中在以下几方面：(1)动物实验造成的脊髓损伤模型与人类的实际情况差别较大，并且目前尚缺乏客观、准确的评价脊髓再生、功能恢复的方法，所以应用细胞移植修复脊髓损伤在其安全性和有效性上仍需要进一步的研究；(2)干细胞移植中存在的定向分化调控，免疫排斥以及伦理学争议等问题尚未得到有效解决；(3)种子细胞移植修复脊髓损伤的机制还没有完全阐明，有不少关键点存在争议。    细胞移植修复脊髓损伤推广应用于临床的工作任重而道远，未来的研究重点主要在以下几个方面：(1)探索合适的种子细胞来源，解决移植中遇到的细胞分化调控、免疫排斥等相关问题；(2)寻找合适的生物支架，不但能够作为合适载体为种子细胞的生长分化提供适宜的微环境，而且可以引导和支持轴突定向生长；(3)通过基因工程技术(基因敲除、基因转染)表达促进脊髓修复的生物活性因子或限制表达不利于脊髓修复的抑制因子；(4)多细胞联合移植，通过筛选种子细胞，优化组合，从而达到分泌足量神经营养因子从而为脊髓修复创造合适微环境的目的。

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作者单位：1.温州医学院附属第二医院骨科，浙江 温州 325027; 2.浙江大学医学院附属第二医院骨科，浙江 杭州 310009